Summary

الكشف القائم على التلوين المناعي للتغيرات الديناميكية في بروتينات خلايا الدم الحمراء

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

يشكل التقاط التغيرات الديناميكية في تنشيط البروتين لخلايا الدم الحمراء المنزوعة النواة تحديات منهجية ، مثل الحفاظ على التغييرات الديناميكية للمنبهات الحادة لتقييمها لاحقا. يصف البروتوكول المقدم تقنيات تحضير العينات وتلطيخها التي تمكن من حفظ وتحليل تغيرات البروتين ذات الصلة والكشف اللاحق.

Abstract

يعد وضع علامات الأجسام المضادة لبروتينات خلايا الدم الحمراء (RBC) طريقة شبه كمية شائعة الاستخدام للكشف عن التغيرات في محتوى البروتين الكلي أو التغيرات الحادة في حالات تنشيط البروتين. يسهل تقييم علاجات كرات الدم الحمراء ، وتوصيف الاختلافات في حالات مرضية معينة ، ووصف التماسك الخلوي. يتطلب الكشف عن تنشيط البروتين المتغير بشكل حاد (على سبيل المثال ، من خلال النقل الميكانيكي) إعدادا كافيا للعينة للحفاظ على تعديلات البروتين المؤقتة. يتضمن المبدأ الأساسي شل حركة مواقع الربط المستهدفة لبروتينات كرات الدم الحمراء المرغوبة لتمكين الارتباط الأولي لأجسام مضادة أولية محددة. تتم معالجة العينة أيضا لضمان الظروف المثلى لربط الجسم المضاد الثانوي بالجسم المضاد الأولي المقابل. يتطلب اختيار الأجسام المضادة الثانوية غير الفلورية علاجا إضافيا ، بما في ذلك اقتران البيوتين-أفيدين وتطبيق 3،3-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB) لتطوير التلوين ، والذي يجب التحكم فيه في الوقت الفعلي تحت المجهر من أجل وقف الأكسدة ، وبالتالي شدة التلوين ، في الوقت المحدد. للكشف عن شدة التلوين ، يتم التقاط الصور باستخدام مجهر ضوئي قياسي. في تعديل هذا البروتوكول ، يمكن تطبيق جسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوريسئين بدلا من ذلك ، والذي يتميز بعدم الحاجة إلى مزيد من خطوات التطوير. ومع ذلك ، يتطلب هذا الإجراء هدفا مضانا متصلا بالمجهر للكشف عن التلطيخ. نظرا للطبيعة شبه الكمية لهذه الطرق ، من الضروري توفير العديد من بقع التحكم لحساب تفاعلات الأجسام المضادة غير المحددة وإشارات الخلفية. هنا ، نقدم كل من بروتوكولات التلوين والعمليات التحليلية المقابلة لمقارنة ومناقشة النتائج والمزايا الخاصة بتقنيات التلوين المختلفة.

Introduction

تجتاز خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) نظام القلب والأوعية الدموية لمدة 70 إلى 140 يوما ، بمتوسط عمر كرات الدم الحمراء حوالي 115 يوما 1,2. تتم إزالة كرات الدم الحمراء الهرمة أو التالفة من الدورة الدموية عن طريق كثرة البلعمة الحمراء ، وهي عملية تطهير فعالة مدفوعة بالبلاعم3. العمر المحدد مسبقا لهذه الخلايا هو أحد نتائج تسليم عضيات الخلية ، بما في ذلك النواة والميتوكوندريا والريبوسومات ، أثناء التمايز والنضج4. وبالتالي ، فإن كرات الدم الحمراء المتداولة خالية من آلية متعدية ، مما يحول دون تخليق بروتينات جديدة3. ويترتب على ذلك أن التعديلات الديناميكية اللاحقة للترجمة على البروتينات الموجودة تمثل الآلية الوحيدة القابلة للتطبيق للتنظيم الكيميائي الحيوي الحاد استجابة للضغوط خارج الخلية وداخل الخلايا التي تعمل على كرات الدمالحمراء 5.

يبدو أن القوى الميكانيكية هي إشارات رئيسية خارج الخلية تسبب تنشيط أو تعديل المسارات الكيميائية الحيوية داخل كرات الدم الحمراء. ألهم اكتشاف البروتين الحساس ميكانيكيا ، Piezo1 ، في أغشية كرات الدمالحمراء 6 عدة خطوط من الأبحاث التي تبحث في الإشارات التي يتم تنشيطها ميكانيكيا في هذه الخلايا7. على سبيل المثال ، أظهرت التطورات الحديثة أن الخصائص الفيزيائية لكرات الدم الحمراء يتم تنظيمها بنشاط من خلال التغيرات الحادة والديناميكية للبروتينات8 ، والتي تشمل الفسفرة بعد الترجمة والوجود في كل مكان9. نظرا لأن هذه التعديلات الطبيعية تختلف في بعض الأمراض9،10،11 ، يبدو أنه من الأهمية العلمية والسريرية تحديد حالة تنشيط بروتينات كرات الدم الحمراء ، وتحديدا فيما يتعلق بالعمليات الميكانيكية البيولوجية.

يطرح تحديد التغيرات الحادة في حالات تنشيط بروتين كرات الدم الحمراء بعض التحديات المنهجية. على سبيل المثال ، يتطلب تخزين عينات كرات الدم الحمراء لتحليلها لاحقا الحفاظ على بروتينات كرات الدم الحمراء المعدلة ، حيث أن التعديلات اللاحقة للترجمة غير دائمة. علاوة على ذلك ، من المعروف أن طرق الكشف عن البروتين الكلاسيكية (على سبيل المثال ، النشاف الغربي) يصعب توحيدها في كرات الدم الحمراء بسبب انخفاض وفرة البروتينات بالنسبة للهيموجلوبين ، والذي يمثل ~ 98٪ من محتوى البروتين في هذه الخلايا12. وبالتالي ، كان التلوين القائم على الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء المحفوظة كيميائيا هو الطريقة المفضلة عند التحقيق في التعديلات الحادة لبروتينات كرات الدم الحمراء المهمة ، مثل الشكل المتماثل الخاص بكرات الدم الحمراء لسينسيز أكسيد النيتريك (RBC-NOS)13,14. لقد ثبت أن RBC-NOS ينتج أكسيد النيتريك (NO) إنزيميا ، والذي يبدو أنه لا غنى عنه لخصائص كرات الدم الحمراء الأساسية ، بما في ذلك تشوه كرات الدم الحمراء15،16،17. تنظم التعديلات اللاحقة للترجمة ل RBC-NOS نشاط الإنزيم التحفيزي ، مع وصف فسفرة بقايا سيرين 1177 لزيادة نشاط الإنزيم ، بينما تم ربط فسفرة بقايا سيرين 114 أو ثريونين 495 بانخفاض نشاط كرات الدم الحمراء18,19.

بشكل جماعي ، تساهم التعديلات المؤقتة لبروتينات كرات الدم الحمراء في وظيفة خلوية مهمة ، والبروتوكولات الموحدة التي تمكن من اكتشاف هذه البروتينات المعدلة ذات قيمة عالية. هنا ، نقدم بروتوكولين متميزين يستغلان أجساما مضادة محددة لتسهيل الكشف عن تنشيط بروتين RBC-NOS ، ونناقش توصيات لتحليل البيانات وتفسيرها.

تم تقييم أداء البروتوكولات الموصوفة من خلال قياس الزيادة المبلغ عنها جيدا في فسفرة كرات الدم الحمراء – NOS في بقايا سيرين 1177 استجابة للقوى الميكانيكية العاكسة لتلك التي تحدث داخل الأوعية الدموية البشرية (5 باسكال).

Protocol

تتوافق البروتوكولات الموضحة هنا مع إعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجان الأخلاقيات في جامعة كولونيا الرياضية الألمانية (9/16/2013) وجامعة جريفيث (2019/808). تم فحص المتطوعين للتأكد من عدم وجود أمراض ذات صلة وقدموا موافقة خطية مستنيرة. 1. تلطيخ بروتينات كرات الدم الحمراء ب…

Representative Results

تم اختبار البروتوكول المقدم ، الذي يصف الطرق التي تسهل الكشف عن التغيرات الحادة في بروتينات كرات الدم الحمراء ، على تغيير بروتين حساس ميكانيكيا معروف: فسفرة RBC-NOS في بقايا سيرين 1177. تم الحصول على الدم الكامل من متطوعين أصحاء ثم تم تقسيمه لاحقا إلى حصتين منفصلتين. تعرضت عينة دم معينة لإجهاد ا…

Discussion

تشير الأدبيات الحديثة بشدة إلى أن بروتين RBC-NOS له أهمية حاسمة لتنظيم تشوه كرات الدم الحمراء15،22،23 ، والذي بدوره يسهل مرورها عبر الشعيرات الدمويةالضيقة 24. يعتمد نشاط البروتين بشكل كبير على تعديلات البروتين بعد الترجمة ، وخاصة ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تقر LK بدعم منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية.

Materials

3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die?. Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Feelisch, M. . Methods in Nitric Oxide Research. , (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Play Video

Cite This Article
Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

View Video