Summary

Rilevazione basata sull'immunocolorazione di alterazioni dinamiche nelle proteine dei globuli rossi

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Catturare i cambiamenti dinamici nell’attivazione proteica dei globuli rossi enucleati pone sfide metodologiche, come la conservazione dei cambiamenti dinamici agli stimoli acuti per una valutazione successiva. Il protocollo presentato descrive la preparazione del campione e le tecniche di colorazione che consentono la conservazione e l’analisi dei cambiamenti proteici rilevanti e la successiva rilevazione.

Abstract

La marcatura anticorpale delle proteine dei globuli rossi (RBC) è un metodo semi-quantitativo comunemente usato per rilevare cambiamenti nel contenuto proteico complessivo o alterazioni acute negli stati di attivazione delle proteine. Facilita la valutazione dei trattamenti con globuli rossi, la caratterizzazione delle differenze in alcuni stati patologici e la descrizione delle coerenze cellulari. Il rilevamento di un’attivazione proteica acutamente alterata (ad esempio, attraverso la meccanotrasduzione) richiede un’adeguata preparazione del campione per preservare modificazioni proteiche altrimenti temporanee. Il principio di base include l’immobilizzazione dei siti di legame bersaglio delle proteine RBC desiderate per consentire il legame iniziale di specifici anticorpi primari. Il campione viene ulteriormente elaborato per garantire condizioni ottimali per il legame dell’anticorpo secondario all’anticorpo primario corrispondente. La selezione di anticorpi secondari non fluorescenti richiede un trattamento aggiuntivo, compreso l’accoppiamento biotina-avidina e l’applicazione di 3,3-diaminobenzidina-tetracloridrato (DAB) per sviluppare la colorazione, che deve essere controllata in tempo reale al microscopio per fermare l’ossidazione, e quindi l’intensità della colorazione, in tempo. Per il rilevamento dell’intensità della colorazione, le immagini vengono scattate utilizzando un microscopio ottico standard. In una modifica di questo protocollo, può essere applicato invece un anticorpo secondario coniugato con fluoresceina, che ha il vantaggio che non è necessaria alcuna ulteriore fase di sviluppo. Questa procedura, tuttavia, richiede un obiettivo di fluorescenza collegato a un microscopio per il rilevamento della colorazione. Data la natura semi-quantitativa di questi metodi, è imperativo fornire diverse colorazioni di controllo per tenere conto delle reazioni anticorpali non specifiche e dei segnali di fondo. Qui, presentiamo sia i protocolli di colorazione che i corrispondenti processi analitici per confrontare e discutere i rispettivi risultati e vantaggi delle diverse tecniche di colorazione.

Introduction

I globuli rossi (RBC) attraversano il sistema cardiovascolare per 70-140 giorni, con un’età media dei globuli rossi di circa 115 giorni 1,2. I globuli rossi senescenti o danneggiati vengono rimossi dalla circolazione mediante eritrofagocitosi, un efficiente processo di compensazione guidato dai macrofagi3. La durata della vita predeterminata di queste cellule è una conseguenza della resa degli organelli cellulari, incluso il nucleo, i mitocondri e i ribosomi, durante la differenziazione e la maturazione4. Pertanto, i globuli rossi circolanti sono privi di un meccanismo traslazionale, precludendo la sintesi di nuove proteine3. Ne consegue che le modificazioni dinamiche post-traduzionali delle proteine esistenti rappresentano l’unico meccanismo praticabile di regolazione biochimica acuta in risposta a fattori di stress extracellulari e intracellulari che agiscono sui globuli rossi5.

Le forze meccaniche sembrano essere i principali segnali extracellulari che causano l’attivazione o la modulazione dei percorsi biochimici all’interno dei globuli rossi. La scoperta della proteina meccanosensibile, Piezo1, nelle membrane RBC6 ha ispirato diverse linee di ricerca che studiano la segnalazione attivata meccanicamente in queste cellule7. Ad esempio, recenti progressi hanno dimostrato che le proprietà fisiche dei globuli rossi sono attivamente regolate da cambiamenti acuti e dinamici delle proteine8, che includono la fosforilazione post-traduzionale e l’ubiquitinazione9. Poiché queste normali modificazioni differiscono in alcune malattie 9,10,11, sembra essere di interesse scientifico e clinico determinare lo stato di attivazione delle proteine RBC, in particolare in relazione ai processi meccanobiologici.

La determinazione di cambiamenti acuti negli stati di attivazione della proteina RBC pone alcune sfide metodologiche. Ad esempio, la conservazione dei campioni di RBC per analisi successive richiede la conservazione delle proteine RBC modificate, poiché le modifiche post-traduzionali non sono durevoli. Inoltre, i metodi classici di rilevamento delle proteine (ad esempio, western blotting) sono notoriamente difficili da standardizzare nei globuli rossi a causa della bassa abbondanza di proteine rispetto all’emoglobina, che rappresenta ~ 98% del contenuto proteico in queste cellule12. Pertanto, la colorazione basata su anticorpi di globuli rossi conservati chimicamente è stato il metodo di scelta quando si studiano le modificazioni acute di importanti proteine RBC, come l’isoforma specifica dei globuli rossi dell’ossido nitrico sintasi (RBC-NOS)13,14. È stato dimostrato che RBC-NOS produce enzimaticamente ossido nitrico (NO), che sembra indispensabile per le proprietà essenziali dei globuli rossi, inclusa la deformabilità dei globuli rossi15,16,17. Le modificazioni post-traduzionali di RBC-NOS regolano l’attività enzimatica catalitica, con la fosforilazione del residuo di serina 1177 descritta per aumentare l’attività enzimatica, mentre la fosforilazione dei residui serina 114 o treonina 495 è stata collegata a una diminuzione dell’attività RBC-NOS18,19.

Collettivamente, le modifiche temporanee delle proteine RBC contribuiscono a importanti funzioni cellulari e i protocolli standardizzati che consentono il rilevamento di queste proteine modificate sono di alto valore. Qui, presentiamo due protocolli distinti che sfruttano anticorpi specifici per facilitare la rilevazione dell’attivazione della proteina RBC-NOS e discutiamo le raccomandazioni per l’analisi e l’interpretazione dei dati.

Le prestazioni dei protocolli descritti sono state valutate misurando l’aumento ben riportato della fosforilazione di RBC-NOS al residuo di serina 1177 in risposta a forze meccaniche riflettenti quelle che si verificano all’interno del sistema vascolaristico umano (5 Pa).

Protocol

I protocolli qui descritti sono in linea con la Dichiarazione di Helsinki e sono stati approvati dai comitati etici dell’Università tedesca dello sport di Colonia (16/09/2013) e dell’Università Griffith (2019/808). I volontari sono stati sottoposti a screening per garantire l’assenza di patologie rilevanti e hanno fornito il consenso informato scritto. 1. Colorazione delle proteine RBC utilizzando protocolli immunoistochimici NOTA: un elenco dettagl…

Representative Results

Il protocollo presentato, che descrive metodi che facilitano la rilevazione di alterazioni acute nelle proteine RBC, è stato testato su una ben nota alterazione proteica meccanicamente sensibile: la fosforilazione di RBC-NOS sul residuo di serina 1177. Il sangue intero è stato ottenuto da volontari sani e successivamente diviso in due aliquote separate. Un dato campione di sangue è stato esposto a sollecitazioni meccaniche di taglio di entità fisiologica (5 Pa) per 300 s, che in precedenza ha dimostrato di provocare …

Discussion

La letteratura recente suggerisce altamente che la proteina RBC-NOS è di cruciale importanza per la regolazione della deformabilità dei globuli rossi 15,22,23, che a sua volta facilita il loro passaggio attraverso capillari stretti 24. L’attività proteica dipende fortemente dalle modificazioni proteiche post-traduzionali, in particolare dalla fosforilazione di alcuni residui18….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LK riconosce il sostegno di una borsa di studio del programma di formazione alla ricerca del governo australiano.

Materials

3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

References

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Cite This Article
Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

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