Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Linhagens celulares de peixes são modelos in vitro promissores para avaliação de ecotoxicidade; no entanto, os sistemas convencionais de cultura monocamada (cultura 2D) têm limitações bem conhecidas (por exemplo, longevidade da cultura e manutenção de algumas funções celulares in vivo ). Assim, culturas 3D, como os esferoides, têm sido propostas, uma vez que esses modelos podem reproduzir estruturas semelhantes a tecidos, recapturando melhor as condições in vivo . Este artigo descreve um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides com duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal). O protocolo consiste em plaquear as células em uma placa de fundo redondo, ultrabaixa e de 96 poços. Após 5 dias sob agitação orbital (70 rpm), um único esferoide por poço é formado. Os esferoides formados apresentam tamanho e forma estáveis, e este método evita a formação de múltiplos esferoides em um poço; assim, não é necessário escolher esferoides de tamanhos semelhantes. A facilidade, velocidade e reprodutibilidade deste método esferoide o tornam útil para testes in vitro de alto rendimento.
Introdução
Esferoides são pequenas esferas de células formadas quando as células são cultivadas em contato próximo célula a célula em cultura 3D. A capacidade dos esferoides de mimetizar o ambiente tecidual in vivo já foi estudada em uma variedade de linhagens celulares e célulasprimárias1,2. No entanto, embora os esferoides estejam bem desenvolvidos para estudos de toxicidade em mamíferos, o desenvolvimento de esferoides para estudos de toxicidade com vertebrados não mamíferos (por exemplo, peixes) ainda está em andamento3. Para linhagens celulares de peixes, esferoides têm sido desenvol....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os principais passos para gerar esferoides 3D de linhas celulares ZFL e ZEM2S em uma placa de fundo redondo de 96 poços são apresentados na Figura 1.
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais usados neste protocolo e a Tabela 1 para soluções e meios de cultura usados neste protocolo.
1. Meio de cultura celular e culturas de monocamada
- Cultivar ambas as linhagens celulares (ZFL, ZEM2S) como monocamadas em uma incubadora a 28 °C sem CO2, e subcultá-las em uma proporç....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Esferoides únicos por poço com tamanho e forma estáveis são formados por este método. A Figura 2 ilustra o processo de formação de esferoides simples de células ZFL e ZEM2S em um poço de uma placa ULA sob agitação orbital (70 rpm). As linhagens celulares ZFL e ZEM2S apresentam comportamentos diferentes em cultura 3D. A linhagem celular ZEM2S apresenta características que conferem a capacidade de formar prontamente uma forma esferoidal desde o primeiro dia de agitação orbital (Figura
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Este é um método simples, fácil e rápido para gerar esferoides de linhagens celulares de fígado e embrião de peixe-zebra. Este método foi desenvolvido por este grupo com base em modificações de métodos esferoides 3D existentes para superar problemas relatados em estudos científicos relacionados à formação de esferoides, bem como incertezas na precisão dos dados de ensaios esferoides 3D. Por exemplo, os problemas relatados residem nas dificuldades de manuseio, na demora na geração de esferoides, na necessidade de selecion.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado a promover a pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade dos equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microplaca de fixação ultrabaixa de fundo redondo transparente de 96 poços, embalada individualmente, com tampa, estéril | Corning | 7007 | |
| DMEM, pó, glicose alta, piruvato | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, pó | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Processamento e análise de imagens em Java ( ImageJ) Software 1.52p | National Institutes of Health, EUA | Disponível em: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, pó | Gibco | 41300021 | |
| Agitador orbital | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm de diâmetro de rotação |
| Dulbeccos PBS (10x) com cálcio e magnésio | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Médio | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Soro Fetal Bovino, qualificado, regiões aprovadas pelo | USDA Gibco | 12657-029 | |
| Bicarbonato de sódio, pó, biorreagente para biologia molecular | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Mancha azul de tripano (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S linha celular | ATCC | CRL-2147 | Esta linha celular foi gentilmente doada pelo Professor Dr. Michael J. Carvan (Universidade de Wisconsin, Milwaukee, EUA) |
| Linha celular ZFL | BCRJ | 256 |
Referências
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
