Ett färdigt att använda fryst lager av neuroner är ett kraftfullt verktyg för att utvärdera synaptiska funktioner. Här introducerar vi en primärkultur med enkel låg densitet från fryst lager med en 96-brunnsplatta.
Neuronal kultur är ett värdefullt system för utvärdering av synaptiska funktioner och läkemedelsscreeningar. I synnerhet möjliggör en lågdensitetskultur av primära hippocampus neuroner studier av enskilda neuroner eller subcellulära komponenter. Vi har visat subcellulär proteinlokalisering inom en neuron genom immunocytokemi, neuronal polaritet, synaptisk morfologi och dess utvecklingsförändring med hjälp av en primär hippocampuskultur med låg densitet. Nyligen har färdiga frysta lager av neuroner blivit kommersiellt tillgängliga. Dessa frysta lager av neuroner minskar den tid som behövs för att förbereda djurförsök och bidrar också till att minska antalet djur som används. Här introducerar vi en reproducerbar primärodlingsmetod med låg densitet med användning av en 96-brunnsplatta. Vi använde ett kommersiellt tillgängligt fryst lager av neuroner från råttembryonal hippocampus. Neuronerna kan odlas stabilt långsiktigt utan medieförändringar genom att minska tillväxten av gliaceller vid vissa tidpunkter. Denna analys med hög genomströmning med hjälp av lågdensitetskultur möjliggör reproducerbara bildbaserade utvärderingar av synaptisk plasticitet.
Utvecklingen av ett in vitro experimentellt system som kan bedöma synaptiska funktioner som är involverade i inlärning och minne är viktigt. Neuronal kultur är ett värdefullt system för utvärdering av synaptiska funktioner in vitro. Den neuronala odlingstekniken användes först på 1980-talet, och på 1990-talet utvecklades lågdensitetskultur av primära hippocampus neuroner 1,2,3 för studier av enskilda neuroner när det gäller subcellulär lokalisering av proteinkomponenter, proteinhandel, neuronal polaritet, ryggradsmorfologi, synapsutveckling och plasticitet 4,5,6,7,8 . Det finns emellertid många steg involverade i denna teknik: parning av djur, dissekering av embryon, förberedelse av odlingskärl och odling av celler i 3 veckor med medieförändringar en gång i veckan. Dessutom kräver det avancerade tekniker3.
Vi har utvecklat frysta bestånd av dissocierade hippocampus neuroner från råttembryon 9,10. De frysta bestånden av neuroner är färdiga att använda, och inga avancerade tekniker krävs för att odla cellerna11,12. Med andra ord beror odling av neuronerna från frysta bestånd inte på en experimenters teknik. Det eliminerar behovet av djurförsök (t.ex. tillstånd för djurförsök, arrangering av tidsinställda dräktiga djur och dissekering av råttembryon), vilket minskar antalet djur som används. Nyligen har högkvalitativa, färdiga att använda frysta lager av neuroner blivit kommersiellt tillgängliga. Här använde vi kommersiellt tillgängliga frysta bestånd från embryonal dag (E) 18 råtta hippocampus13,14,15. Odling av neuroner från ett fryst bestånd kräver inte glia-konditionerade medier eller samodling med gliaceller. Vanliga primära odlingsmedier utan ytterligare serum kan användas för att odla cellerna; Därför kan vi skaffa reproducerbara data. Dessutom finns det inget behov av medieutbyte under 3 veckor efter cellsådden eftersom tillväxten av gliaceller minskar (figur 1).
Dendritiska spines är det postsynaptiska facket i de flesta excitatoriska synapser. De innehåller receptorproteiner, postsynaptiska ställningsproteiner och aktincytoskeletala proteiner. Vi fokuserade på ett aktinbindande protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin ackumuleras vid ryggradshuvudet i mogna neuroner19, och vi rapporterade drebrin som en markör för det synaptiska tillståndet 15,17,20,21,22,23. Genom att genomföra en höginnehållsanalys med drebrin som avläsning har vi nyligen rapporterat de hämmande effekterna av fencyklidinanaloger på N-metyl-D-asparaginsyra-typ glutamatreceptorer (NMDAR)10 och de NMDAR-beroende effekterna av naturliga föreningar och råläkemedel på synaptiska tillstånd15.
Här beskriver vi hur man odlar frysta lager av neuroner vid låg densitet. Dessutom visar vi en drebrin imaging-baserad utvärdering av det synaptiska tillståndet med hjälp av 96-brunnsplattor.
Ett kritiskt steg i denna metod är att tina cellsuspensionen. Överföring av cellsuspensionen innan den blir för varm är mycket viktig. För att undvika snabb förändring av osmolalitet överför emellertid inte cellsuspensionen till en stor volym av mediet på en gång. Droppvis tillsats av odlingsmediet är också avgörande för att undvika plötsliga förändringar i osmotiskt tryck.
Neuronerna kan odlas i andra odlingskärl: 24-brunnsplattor, 8-brunnskammare, 60 mm skålar eller MED-sonder. I dessa fall måste dock den slutliga koncentrationen och tidpunkten för tillsatsen av Ara-C justeras. Dessutom måste neurons densitet optimeras i olika typer av experiment. Till exempel krävs högdensitetskultur för elektrofysiologiska experiment, och i så fall behövs medieutbytet två gånger i veckan (figur 6). Således kräver en lågdensitetskultur färre steg än en högdensitetskultur.
Neuronal kultur med låg densitet kräver ofta avancerade tekniker; Att använda fryst lager som är färdigt att använda löser dock detta problem. Den beskrivna metoden beror inte på en experimenters skicklighet. Kvaliteten på fryst lager är stabil och kan odlas stabilt så länge de lagras i flytande kväve och undviker temperaturförändringar i upp till 4 år.
Odling av cellerna i 3 veckor utan medelutbyte väcker frågan om det finns signifikanta osmolalitetsförändringar eller avdunstning av odlingsmedia. Vi har dock bekräftat att avdunstningen av odlingsmedier är liten (minskningsgrad på 3,6 %). Lokaliseringen av synaptiska proteiner och neurons morfologi verkar normal efter 3 veckor. Därför orsakar 3-veckors kultur utan medieutbyte inte stora osmolalitetsförändringar som påverkar förhållandena hos de odlade neuronerna. Att hålla plattan i en inkubator efter Ara-C-behandling är också en viktig punkt som minimerar avdunstningen.
Det finns ingen begränsning när det gäller användningen av frysta stamneuroner. Det finns emellertid vissa begränsningar av lågdensitetsodlingsmetoden. Vi bekräftade att lågdensitetskulturen kunde tillämpas för morfologisk observation av neuroner, utvärdering av synaptisk funktion och GFP-transfektion. Vi har dock inte undersökt levande cellavbildning. Dessutom, som nämnts ovan, krävs högdensitetskultur för att utföra elektrofysiologi.
Synapsmognad tar vanligtvis 3 veckor7, och vi kan inte bekräfta att de odlade neuronerna har ordentliga synapser förrän i slutet. Om synapsmognaden inte är bra efter 3 veckor skulle vi behöva odla igen. Genom att känna till neuronernas kvalitet innan vi börjar experimenten kan vi spara dessa 3 veckor. För att utföra experiment effektivt är det därför bäst att kontrollera neurons kvalitet i förväg. Frysta lager gör det möjligt att kontrollera neurons kvalitet i förväg. Varje parti frysta lager genereras från en kull råttor, och vi kan använda ett av bestånden från varje parti för en kvalitetskontroll. Drebrin är en bra markör för kvalitetskontrollen av neuronerna. Som beskrivits ackumuleras drebrin i ryggradshuvudet i mogna neuroner, och det reagerar på synaptisk stimulering. Således kan vi kontrollera kvaliteten på neuronerna i frysta bestånd genom att använda drebrin som markör.
Denna metod kan tillämpas för att utvärdera effekten av läkemedel på det synaptiska tillståndet. Drebrinutvandringen från dendritiska spines uppträder under de inledande stadierna av synaptisk plasticitet22. Därför visar detekteringen av drebrinklusterreduktion framkallad av läkemedelsbehandling att läkemedlet stimulerar synapsen och orsakar synaptisk plasticitet. För att identifiera om reduktionen är NMDAR-beroende är ett experiment med 2-amino-5-fosfonovalersyra (APV, en NMDAR-antagonist) användbar. Med drebrin som markör är även ett NMDAR-beroende klart bestämt10,15. Den beskrivna metoden är användbar vid läkemedelsscreening, säkerhetsfarmakologiska studier och utvärdering av synaptisk funktion.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Kazumi Kamiyama och Manami Kawada för hjälp med experiment. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (bidragsnummer 19K08010 till N.K.) och Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (bidragsnummer JP19bk0104077 och JP22bm0804024 till T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |