उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन और संवर्धन
Summary
रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) एक त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति है जो विट्रो में ट्यूमर के वातावरण की नकल कर सकती है। उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर में, पीडीओ नए बायोमाकर्स और चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Abstract
ऑर्गेनोइड्स 3 डी गतिशील ट्यूमर मॉडल हैं जिन्हें रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि ट्यूमर ऊतक, जलोदर, या फुफ्फुस द्रव से सफलतापूर्वक उगाया जा सकता है और डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए नए चिकित्सीय और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज में सहायता करता है। ये मॉडल क्लोनल विषमता, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को पुन: परिभाषित करते हैं। इसके अतिरिक्त, उन्हें प्राथमिक ट्यूमर को रूपात्मक, साइटोलॉजिकल, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और आनुवंशिक रूप से मेल खाने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, ऑर्गेनोइड ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर शोध की सुविधा प्रदान करते हैं और सेल लाइनों से बेहतर होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल 97% से अधिक सफलता दर के साथ रोगी ट्यूमर, जलोदर और फुफ्फुस द्रव के नमूनों से रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग तरीकों का वर्णन करता है। रोगी के नमूने यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन दोनों द्वारा सेलुलर निलंबन में अलग किए जाते हैं। कोशिकाओं को तब एक तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) का उपयोग करके चढ़ाया जाता है और उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी) के संवर्धन के लिए विशिष्ट पूरक युक्त अनुकूलित विकास मीडिया के साथ समर्थित किया जाता है। प्रारंभिक ऑर्गेनोइडबनाने के बाद, पीडीओ दीर्घकालिक संस्कृति को बनाए रख सकते हैं, जिसमें बाद के प्रयोगों के लिए विस्तार के लिए पासिंग शामिल है।
Introduction
2021 में, संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 21,410 महिलाओं को उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर का निदान किया गया था, और 12,940 महिलाओं कीइस बीमारी से मृत्यु हो गई थी। यद्यपि सर्जरी और कीमोथेरेपी में पर्याप्त प्रगति हुई है, उन्नत बीमारी वाले 70% से अधिक रोगी कीमोथेरेपी प्रतिरोध विकसित करते हैं और निदान2,3 के 5 साल के भीतर मर जाते हैं। इस प्रकार, इस घातक बीमारी के इलाज के लिए नई रणनीतियों और प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए प्रतिनिधि, विश्वसनीय मॉडल की तत्काल आवश्यकता है।
प्राथमिक डिम्बग्रंथि ट्यूमर से निर्मित कैंसर सेल लाइनें और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले मुख्य उपकरण हैं। कैंसर सेल लाइनों का एक प्रमुख लाभ उनका तेजी से विस्तार है। हालांकि, उनकी निरंतर संस्कृति के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक परिवर्तन होते हैं जो कैंसर सेल लाइनों को मूल प्राथमिक कैंसर ट्यूमर नमूने से विचलित करने का कारण बनते हैं। कैंसर सेल लाइन और प्राथमिक ट्यूमर के बीच मौजूदा अंतर के कारण, सेल लाइनों में सकारात्मक प्रभाव डालने वाली दवा परखनैदानिक परीक्षणों में इन समान प्रभावों को रखने में विफल रहती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पीडीएक्स मॉडल का उपयोग किया जाता है। ये मॉडल इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में ताजा डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों को प्रत्यारोपित करके बनाए जाते हैं। जैसा कि वे विवो मॉडल में हैं, वे अधिक सटीक रूप से मानव जैविक विशेषताओं से मिलते जुलते हैं और बदले में, दवा के परिणामों की अधिक भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, इन मॉडलों में महत्वपूर्ण सीमाएं भी हैं, जिनमें उन्हें उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लागत, समय और संसाधन शामिलहैं।
पीडीओ प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करते हैं जो कैंसर सेल लाइनों और पीडीएक्स मॉडल दोनों की सीमाओं को दूर करता है। पीडीओ एक रोगी के ट्यूमर और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करते हैं और इस प्रकार, प्रीक्लिनिकल अनुसंधान 2,3,5 के लिए आदर्श इन विट्रो ट्रैक्टेबल मॉडल प्रदान करते हैं। इन 3 डी मॉडलों में स्व-संगठन क्षमताएं होती हैं जो प्राथमिक ट्यूमर को मॉडल करती हैं, जो एक ऐसी विशेषता है जो उनके दो-आयामी (2 डी) सेल लाइन समकक्षों के पास नहीं है। इसके अलावा, इन मॉडलों को आनुवंशिक और कार्यात्मक रूप से उनके मूल ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है और इस प्रकार, नए चिकित्सीय और जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय मॉडल हैं। संक्षेप में, वे सेल लाइनों के समान दीर्घकालिक विस्तार और भंडारण क्षमताओं की पेशकश करते हैं, लेकिन माउस मॉडल 4,6 में निहित माइक्रोएन्वायरमेंट और सेल-सेल इंटरैक्शन को भी शामिल करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल 97% से अधिक सफलता दर के साथ रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर, जलोदर और फुफ्फुस द्रव नमूनों से पीडीओ के निर्माण का वर्णन करता है। पीडीओ संस्कृतियों को तब कई पीढ़ियों के लिए विस्तारित किया जा सकता है और दवा चिकित्सा संवेदनशीलता और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह विधि एक ऐसी तकनीक का प्रतिनिधित्व करती है जिसका उपयोग पीडीओ की चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं के आधार पर उपचार को निजीकृत करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिम्बग्रंथि का कैंसर निदान में अपने उन्नत चरण के साथ-साथ कीमोथेरेपी प्रतिरोध के सामान्य विकास के कारण बेहद घातक है। कैंसर सेल लाइनों और पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने में एमडी, पीएचडी रॉन बोस के मार्गदर्शन और बारबरा ब्लाचट, एमडी की सहायता के लिए आभारी हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए सेंट लुइस के प्रसूति और स्त्री रोग विभाग और स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी विभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के डीन स्कॉलर प्रोग्राम और प्रजनन वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
