Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau
Summary
Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.
Abstract
Os organoides são modelos de tumores dinâmicos 3D que podem ser cultivados com sucesso a partir de tecido tumoral de ovário derivado do paciente, ascite ou líquido pleural e ajudam na descoberta de novas terapêuticas e biomarcadores preditivos para o câncer de ovário. Esses modelos recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Além disso, eles demonstraram corresponder ao tumor primário morfologicamente, citologicamente, imuno-histoquimicamente e geneticamente. Assim, os organoides facilitam a pesquisa sobre as células tumorais e o microambiente tumoral e são superiores às linhagens celulares. O presente protocolo descreve métodos distintos para gerar organoides de câncer de ovário derivados de pacientes a partir de tumores, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As amostras do paciente são separadas em suspensões celulares por digestão mecânica e enzimática. As células são então banhadas utilizando um extrato de membrana basal (BME) e são suportadas com meios de crescimento otimizados contendo suplementos específicos para a cultura de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC). Depois de formar organoides iniciais, as DOP podem sustentar a cultura a longo prazo, incluindo a passagem para expansão para experimentos subsequentes.
Introduction
Em 2021, aproximadamente 21.410 mulheres nos Estados Unidos foram recém-diagnosticadas com câncer de ovário epitelial, e 12.940 mulheres morreram dessa doença1. Embora avanços suficientes tenham sido feitos na cirurgia e na quimioterapia, mais de 70% dos pacientes com doença avançada desenvolvem resistência quimioterápica e morrem dentro de 5 anos após o diagnóstico 2,3. Assim, novas estratégias para tratar esta doença mortal e modelos representativos e confiáveis para a pesquisa pré-clínica são urgentemente necessários.
Linhagens celulares de câncer e xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) criados a partir de tumores primários de ovário são os principais instrumentos utilizados na pesquisa do câncer de ovário. Uma grande vantagem das linhagens celulares de câncer é a sua rápida expansão. No entanto, sua cultura contínua resulta em alterações fenotípicas e genotípicas que fazem com que as linhagens celulares cancerígenas se desviem da amostra original de tumor primário de câncer. Devido às diferenças existentes entre a linhagem celular cancerígena e o tumor primário, os ensaios de drogas que têm efeitos positivos em linhagens celulares não conseguem ter esses mesmos efeitos em ensaios clínicos2. Para superar essas limitações, os modelos PDX são usados. Esses modelos são criados pela implantação de tecido fresco de câncer de ovário em camundongos imunodeficientes. Como são modelos in vivo , eles se assemelham com mais precisão às características biológicas humanas e, por sua vez, são mais preditivos dos resultados das drogas. No entanto, esses modelos também apresentam limitações significativas, incluindo o custo, o tempo e os recursos necessários para gerá-los4.
As DOP oferecem um modelo alternativo para pesquisa pré-clínica que supera as limitações de ambas as linhagens celulares de câncer e modelos PDX. As DOP recapitulam o tumor e o microambiente tumoral de um paciente e, assim, fornecem um modelo tratável in vitro ideal para a pesquisa pré-clínica 2,3,5. Esses modelos 3D têm capacidades de auto-organização que modelam o tumor primário, que é uma característica que suas contrapartes de linhagem celular bidimensional (2D) não possuem. Além disso, esses modelos demonstraram representar geneticamente e funcionalmente seus tumores pais e, portanto, são modelos confiáveis para o estudo de novas terapêuticas e processos biológicos. Em suma, oferecem capacidades de expansão e armazenamento a longo prazo semelhantes às linhagens celulares, mas também abrangem o microambiente e as interações célula-célula inerentes aos modelos de camundongos 4,6.
O presente protocolo descreve a criação de DOP a partir de tumores derivados de pacientes, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As culturas de DOP podem então ser expandidas por várias gerações e usadas para testar a sensibilidade à terapia medicamentosa e biomarcadores preditivos. Este método representa uma técnica que poderia ser utilizada para personalizar tratamentos com base nas respostas terapêuticas das DOP.
Protocol
Representative Results
Discussion
O câncer de ovário é extremamente mortal devido ao seu estágio avançado no diagnóstico, bem como ao desenvolvimento comum de resistência à quimioterapia. Muitos avanços na pesquisa do câncer de ovário foram feitos utilizando linhas celulares de câncer e modelos PDX; no entanto, há uma necessidade evidente de um modelo in vitro mais representativo e acessível. As DOP têm demonstrado representar com precisão a heterogeneidade tumoral, o microambiente tumoral e as características genômicas e trans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos pela orientação de Ron Bose, MD, PhD, e pela assistência de Barbara Blachut, MD, no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Decano da Universidade de Washington e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.
Materials
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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