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Medicine

बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूले का उपयोग करके विश्राम का यांत्रिक नियंत्रण

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64879
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Physiology, Wayne State University, 2School of Medicine, Michigan State University-Macomb and Department of Physiology, Wayne State University

Summary

सामान्य शरीर विज्ञान के लिए तेजी से मायोकार्डियल और कार्डियक विश्राम आवश्यक है। यांत्रिक विश्राम तंत्र अब तनाव दर पर निर्भर होने के लिए जाना जाता है। यह प्रोटोकॉल विश्राम के यांत्रिक नियंत्रण का आगे अध्ययन करने के लिए प्रयोगों के अधिग्रहण और विश्लेषण का अवलोकन प्रदान करता है।

Abstract

डायस्टोलिक डिसफंक्शन कार्डियोवैस्कुलर रोग प्रस्तुतियों में एक सामान्य फेनोटाइप है। ऊंचा हृदय कठोरता (ऊंचा बाएं वेंट्रिकुलर एंड-डायस्टोलिक दबाव) के अलावा, बिगड़ा हुआ हृदय विश्राम डायस्टोलिक शिथिलता का एक प्रमुख नैदानिक संकेतक है। जबकि विश्राम के लिए साइटोसोलिक कैल्शियम को हटाने और सार्कोमेरिक पतले फिलामेंट्स को निष्क्रिय करने की आवश्यकता होती है, ऐसे तंत्र को लक्षित करना अभी तक प्रभावी उपचार प्रदान नहीं कर पाया है। यांत्रिक तंत्र, जैसे रक्तचाप (यानी, आफ्टरलोड), विश्राम को संशोधित करने के लिए सिद्धांतित किया गया है। हाल ही में, हमने दिखाया कि खिंचाव की तनाव दर को संशोधित करना, न कि आफ्टरलोड, मायोकार्डियल ऊतक की बाद की विश्राम दर को संशोधित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों था। विश्राम की तनाव दर निर्भरता, जिसे मैकेनिकल कंट्रोल ऑफ रिलैक्सेशन (एमसीआर) कहा जाता है, का आकलन बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूका का उपयोग करके किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक छोटे पशु मॉडल, प्रयोगात्मक प्रणाली और कक्ष की तैयारी, हृदय के अलगाव और बाद में एक ट्रेबेकुला के अलगाव, प्रयोगात्मक कक्ष की तैयारी, और प्रयोगात्मक और विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। बरकरार दिल में उपभेदों को लंबा करने के सबूत बताते हैं कि एमसीआर औषधीय उपचार के बेहतर लक्षण वर्णन के लिए नए क्षेत्र प्रदान कर सकता है, साथ ही बरकरार मांसपेशियों में मायोफिलामेंट कैनेटीक्स का आकलन करने की एक विधि के साथ। इसलिए, एमसीआर का अध्ययन दिल की विफलता के उपचार में नए दृष्टिकोण और नए मोर्चों के लिए एक रास्ता स्पष्ट कर सकता है।

Introduction

हृदय की विफलता के लगभग सभी रूपों में कार्डियक विश्राम बिगड़ा हुआ है (कम इजेक्शन अंश के साथ दिल की विफलता सहित) और कई कार्डियोवैस्कुलर बीमारियों में। परमेबिलाइज्ड मांसपेशियों में कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के कई तरीकों के अलावा, बरकरार हृदय की मांसपेशियों का मूल्यांकन रुचि प्राप्त कर रहा है। ऐसे ऊतकों का मूल्यांकन अनलोडेड (अनुबंध के लिए मुक्त छोर) या लोड (लंबाई या बल नियंत्रित) किया जाता है। ऐतिहासिक रूप से, बरकरार पृथक मायोसाइट्स का मूल्यांकन एक अनलोडेड स्थिति में किया गया है, जहां कोशिका शरीर संकुचन के दौरान छोटा होने के लिए स्वतंत्र है। बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूले का मूल्यांकन अक्सर आइसोमेट्रिक स्थितियों में किया जाता है, जहां लंबाई को बदलने की अनुमति नहीं होती है, लेकिन तनाव (प्रति पार-अनुभागीय क्षेत्र बल) उत्पन्न होता है। बरकरार मायोसाइट और ट्रेबेक्यूले दोनों विधियां लोड 1,2 के संशोधनों के साथ अभिसरण करना शुरू कर रही हैं।

एक मांसपेशी को लोड-क्लैंपिंग के लिए प्रोटोकॉल (यानी, एक निर्दिष्ट मूल्य पर एक मांसपेशी के विकसित तनाव को नियंत्रित करना जो फिजियोलॉजिकल आफ्टरलोड का अनुकरण करता है)कई दशकों में विकसित किए गए हैं। बरकरार हृदय ऊतकों में, लोड-क्लैंप शोधकर्ताओं को आइसोटोनिक या विंडकेसल जैसे आफ्टरलोड 6,7,8,9 का उपयोग करके विवो कार्डियक चक्र में अधिक बारीकी से नकल करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एमसीआर (यानी, छूट दर की तनाव दर निर्भरता) 8,9 को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा प्राप्त करना है।

जबकि एमसीआर प्रोटोकॉल को पूर्व कार्य से अनुकूलित किया गया है, इस प्रोटोकॉल का ध्यान (बरकरार हृदय ऊतकों का उपयोग करने वाले समान प्रोटोकॉल की तुलना में) बायोमेकेनिकल तंत्र पर है जो विश्राम को संशोधित करता है। लोड-क्लैंपिंग 3,4,5,7,10 का उपयोग करने वाले कई प्रोटोकॉल हैं और विंडकेसेल मॉडल 1,2,11 पर ध्यान केंद्रित करने वाले प्रोटोकॉल हैं, लेकिन यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से वर्णन करता है कि विश्राम से पहले खिंचाव विश्राम दर को कैसे संशोधित करता है। हमने दिखाया है कि यह नियंत्रण प्रोटो-डायस्टोलिक अवधि8 के दौरान होता है, एक चरण जो मूल रूप से विगर्स12 द्वारा वर्णित है। सामान्य स्वस्थ दिलों में, मायोकार्डियम महाधमनी वाल्व बंद होने से पहले इजेक्शन के दौरान एक लंबा तनाव से गुजरता है (यानी, आइसोवोलुमिक विश्राम से पहले)13। यह आफ्टरलोड नियंत्रण की अवधि को लम्बा करके नकल की जाती है जब तक कि मांसपेशियों में खिंचाव शुरू न हो जाए। नैदानिक साक्ष्य बताते हैं कि यह लंबा पन रोगराज्यों 14 में क्षीण या खो सकता है, और परिवर्तित अंत-सिस्टोलिक तनाव दरों के निहितार्थ और तंत्र पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किए गए हैं। एक संरक्षित इजेक्शन अंश के साथ डायस्टोलिक रोगों और दिल की विफलता के लिए विरल उपचार विकल्पों को देखते हुए, हम मानते हैं कि एमसीआर बिगड़ा हुआ विश्राम अंतर्निहित नए तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

जबकि यहां वर्णित सकल विच्छेदन कृन्तकों पर केंद्रित है, ट्रेबेकुला अलगाव किसी भी बरकरार दिल से किया जा सकता है, और पहले मानव कार्डियक ट्रेबेकुला8 के साथ इस्तेमाल किया गया है। इसी तरह, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कार्डियोमायोसाइट्स या अन्य पृथक मांसपेशी प्रकार 1,10 पर भी लागू किया जा सकता है। चर्चा में सीमाओं के साथ-साथ विधि में संभावित परिवर्तन और अनुकूलन पर टिप्पणी शामिल है, जैसे कि कॉर्डे9 के यांत्रिक गुणों के कारण पैपिलरी मांसपेशियों का उपयोग करने के खिलाफ सावधानी।

Protocol

वेन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निम्नलिखित प्रोटोकॉल को मंजूरी दी गई है। प्रोटोकॉल यहां कृंतक प्रयोगात्मक विषयों का उपयोग करने के लिए चरणों का वर्णन करता है, लेकिन अन्य मॉडल जीवों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

1. तैयारी

  1. प्रयोगात्मक विषय प्राप्त करें और इसे प्रयोगशाला में अनुकूलित करने की अनुमति दें।
  2. पीएच 7.3 के साथ ओ2 के 10-20 पीपीएम में से प्रत्येक को ऑक्सीजन करके छिड़काव समाधान के 250 एमएल और संशोधित टाइरोड के समाधान के 250 एमएल (तालिका 1) तैयार करें।
  3. एक कैनुला संलग्न के साथ एक 5 एमएल सिरिंज तैयार करें। छिड़काव समाधान के साथ सिरिंज भरें। कैनुला का उपयोग करें जो माउस के लिए 23 ग्राम हैं, और एक छोटे या बड़े चूहे के लिए क्रमशः 18 या 16 ग्राम हैं। एक कुंद सुई (सामग्री की तालिका) के अंत पर पॉलीथीन (पीई) ट्यूबिंग की 1 मिमी लंबाई स्लाइड करें, ताकि महाधमनी को बांधने के बाद कैनुला से फिसलने से रोकने में मदद मिल सके।
  4. विच्छेदन और प्रवेशनी क्षेत्र की पूरी तैयारी (चित्रा 1)।
    1. छिड़काव समाधान के साथ कम से कम आधे रास्ते में दो साफ वजन वाली नौकाओं को भरें। कैनुला के सिरे को छिड़काव घोल में डुबोएं, जिसमें कैनुला के चारों ओर कम से कम एक डबल-लूप सीवन रखा जाए। सिरिंज को बार क्लैंप के साथ रखें।
    2. आसान पहुंच के लिए सर्जिकल कैंची, एक हेमोस्टैट, आईरिस फोर्स, छोटी घुमावदार कैंची की एक जोड़ी और दो # 3 फोर्सप्स रखें।
  5. पूरे प्रयोगात्मक प्रणाली में संशोधित टाइरोड के समाधान को प्राइमिंग और प्रसारित करके प्रयोगात्मक प्रणाली (चित्रा 2) तैयार करें। सुनिश्चित करें कि कक्ष पूरी तरह से भरा और स्थिर है।
  6. बल ट्रांसड्यूसर, लंबाई मोटर, पेसिंग सिस्टम, तापमान नियंत्रण प्रणाली और डेटा अधिग्रहण कंप्यूटर सहित सभी डेटा अधिग्रहण बक्से चालू करें।
  7. वर्तमान प्रयोग को संदर्भित करने के लिए आवश्यक *.dap और सूचक फ़ाइलों वाले टेम्पलेट फ़ोल्डर की प्रतिलिपि बनाएँ और उसका नाम बदलें. डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें।
  8. धातु को प्रोटीन के साथ कोट करने के लिए अल्ट्राप्योर पानी या छिड़काव समाधान में 10% (डब्ल्यू / वी) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) में अपनी युक्तियों को डुबोकर ट्रैबेकुला अलगाव उपकरण (वन्नास कैंची, # 5 या # 55 फोर्स, ग्लास प्रोब) तैयार करें (चित्रा 2 बी)।
    नोट: विच्छेदन से पहले पूरी प्रयोगात्मक प्रणाली तैयार की जानी चाहिए।

2. सकल विच्छेदन और प्रवेशनी।

  1. पशु विषय की पहचान, शरीर के वजन और अन्य प्रासंगिक जानकारी रिकॉर्ड करें।
  2. वैकल्पिक रूप से, इच्छामृत्यु से कम से कम 10 मिनट पहले इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से कृंतक को बाँझ नमकीन में 1,000 यू / किग्रा हेपरिन इंजेक्ट करें, ताकि कोरोनरी छिड़काव से पहले थक्के के जोखिम को कम किया जा सके।
  3. पशु को एक प्रेरण कक्ष में रखें और मानक प्रक्रिया के अनुसार, 100% ऑक्सीजन में 3% -5% आइसोफ्लुरेन वाष्पीकृत का उपयोग करके सामान्य संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
    नोट: आइसोफ्लुरेन के संपर्क को कम करने के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी बाहरी मेहतर, डाउन ड्राफ्ट टेबल, या फ्यूम हुड को चालू करें।
  4. एक बार जब कृंतक अपना दाहिना प्रतिवर्त खो देता है और श्वास दर धीमी हो जाती है:
    1. (एक चूहे के लिए) जानवर को प्रेरण कक्ष से हटा दें और इसे नाक शंकु के माध्यम से निरंतर संज्ञाहरण के साथ विच्छेदन पैड पर रखें।
    2. (माउस के लिए) प्रेरण कक्ष से जानवर को हटाने के तुरंत बाद ग्रीवा अव्यवस्था करें। नाक शंकु आवश्यक नहीं है। आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 0% तक बदल दें।
  5. यदि आवश्यक हो, तो कृंतक के ऊपरी अंगों को पिन द्वारा समर्थित टेप का उपयोग करके छाती की दीवार से दूर विच्छेदन पैड से चिपकाएं, इस बात का ध्यान रखें कि जानवर में छेद न हो। विच्छेदन के लिए आगे बढ़ने से पहले उचित संज्ञाहरण गहराई (पैर की अंगुली-चुटकी प्रतिक्रिया की कमी) की जांच करें।
  6. सर्जिकल कैंची (चूहों के लिए मेयो, चूहों के लिए मेटजेनबाम) का उपयोग करके, जाइफॉइड प्रक्रिया के ठीक नीचे, कृंतक के पेट की पूरी चौड़ाई में त्वचा को पेरिटोनियल स्पेस में काट दें।
  7. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, अनुप्रस्थ कट से छाती की दीवार के बाएं और दाएं दोनों किनारों पर दो ऊर्ध्वाधर कट (छाती की दीवार के किनारों तक) बनाएं। फिर, डायाफ्राम को काट लें, पैरा-कट को जोड़ दें, और वक्ष स्थान को मुक्त करें।
  8. कृंतक के सिर की ओर हेमोस्टैट का उपयोग करके जाइफॉइड प्रक्रिया को दबाएं और उठाएं, उरोस्थि और छाती की दीवार को कृंतक के सिर की ओर ले जाएं, वक्ष स्थान और हृदय को उजागर करें। यदि आवश्यक हो, तो हृदय को पूरी तरह से उजागर करने और / या पेरिकार्डियल झिल्ली को तोड़ने के लिए, पैरा-कट को दूसरे कशेरुक स्थान के पास तक जल्दी से विस्तारित करें।
  9. घुमावदार आईरिस बल का उपयोग करके, महान वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए दिल को ध्यान से उठाएं। मायोकार्डियम और कृंतक की रीढ़ के बीच बल रखें, अधिक वाहिकाओं पर शिकंजा कसें, और हृदय को उठाएं, ध्यान रखें कि एट्रिया या वेंट्रिकुलर खंडों को दबाना न हो।
    1. दिल को थोड़ा ऊपर उठाते हुए, जल्दी से घुमावदार आईरिस कैंची (अवतल ऊपर) को घुमावदार आईरिस बल और कृंतक की रीढ़ के बीच रखें, और महान वाहिकाओं और फेफड़ों को दिल से दूर काट दें। जल्दी से दिल को एक वजन नाव या बीकर में ले जाएं जिसमें ताजा छिड़काव समाधान हो, और दिल से रक्त को साफ करने में मदद करने के लिए हिलाएं।
  10. आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र को 0% तक चालू करें, यदि पहले से नहीं किया गया है। यदि फेफड़े, पेरिकार्डियल या अन्य ऊतकों के बड़े खंड हृदय से जुड़े रहते हैं, तो कैनुलाशन के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए इस समय सावधानीपूर्वक काट लें और उन्हें छोड़ दें।
  11. घुमावदार आईरिस बल का उपयोग करके, तैयार कैनुला को जलमग्न करने के साथ, दिल को एक साफ वजन वाली नाव या बीकर में ले जाएं। महाधमनी को प्रवेशनी करें, लूप किए गए रेशम सीवन को कसकर महाधमनी को सुरक्षित करें, और छिड़काव समाधान के 5 मिलीलीटर तक फ्लश करें।
  12. कैनुला से दिल निकालें और इसे ट्रेबेकुला अलगाव के लिए तैयार करने के लिए सिलिकॉन इलास्टोमर-लेपित वजन पकवान में रखें।

3. ट्रेबेकुला का अलगाव और संतुलन

  1. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे सिलिकॉन इलास्टोमेर-लेपित पकवान में दिल रखें और इसे रोशन करें।
  2. सही वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ का पता लगाएं। डिश में सिलिकॉन इलास्टोमेर के लिए बाएं आलिंद और वेंट्रिकुलर एपेक्स को पिन करें।
  3. लंबी वन्नास कैंची का उपयोग करके, दाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ से सेप्टम के साथ शीर्ष तक काट लें। दाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ से महाधमनी के पास दाएं आलिंद में काटें, फिर दाएं आलिंद के माध्यम से काट ें (चित्रा 3 बी)।
  4. बल का उपयोग करके, बहिर्वाह पथ से दाएं वेंट्रिकुलर (आरवी) मुक्त दीवार को सावधानीपूर्वक खोलें, ऊतक को फैलाने के लिए सावधान रहें।
    नोट: प्रयोगकर्ताओं को पतले, सफेद संयोजी ऊतक किस्में मिल सकती हैं, जिन्हें चिंता के बिना काटा जा सकता है। बड़े, गुलाबी (ऊतक) रंग के किस्में का मूल्यांकन देखभाल के साथ किया जाना चाहिए, क्योंकि वे त्रिकोणीय हो सकते हैं जिन्हें अलग किया जा सकता है।
  5. दाएं वेंट्रिकल को उजागर करने के लिए, डिश में दाएं वेंट्रिकल त्रिकोण की मुक्त दीवार को पिन करें (चित्रा 3 सी)।
  6. एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके जिसे पिघलाया गया है और एक पतली (<500 μm व्यास) के साथ बनाया गया है, लेकिन तेज अंत नहीं है, मुक्त-खड़े ट्रेबेक्यूके के लिए उजागर एंडोकार्डियम की खोज करें (चित्रा 3 सी)।
    नोट: एक फ्री-स्टैंडिंग ट्रैबेकुला मांसपेशियों की एक पट्टी है जिसे कोई पूरी तरह से नीचे जांच सकता है। त्रिकोणीय पैपिलरी मांसपेशियों से बचने के लिए समानांतर पक्ष (निरंतर चौड़ाई) वाले ट्रेबेक्यूले का उपयोग करें। इस प्रक्रिया और बाद के विच्छेदन के दौरान सावधान रहें, क्योंकि ट्रेबेकुला पर तनाव लागू करने से नुकसान हो सकता है, विकसित बल कम हो सकता है।
  7. छोटे वन्नास कैंची का उपयोग करके ट्रेबेकुला का विच्छेदन करें। लगाव की अनुमति देने के लिए ट्रेबेकुला के प्रत्येक छोर पर ऊतक का एक ≥1 मिमी घन टुकड़ा छोड़ दें। जहां संभव हो ट्रेबेकुला को न फैलाएं, और धातु के उपकरणों के संपर्क को कम करें, क्योंकि दोनों मांसपेशियों को नुकसान भी पहुंचा सकते हैं। पहचाने गए ट्रेबेक्यूके के पास मांसपेशियों पर तनाव को कम करने के लिए आवश्यकतानुसार हृदय को पकड़ने वाले पिन को स्थानांतरित करें।
  8. 7 एमएल ट्रांसफर पिपेट के अंत से ~ 2 इंच काटें, धीरे-धीरे ट्रेबेकुला को पिपेट में खींचें, और इसे 50% छिड़काव समाधान और 50% संशोधित टाइरोड के समाधान वाले एक नए वजन पकवान में स्थानांतरित करें। मांसपेशियों को कई मिनटों के लिए मिश्रित घोल के भीतर बाह्य कैल्शियम में वृद्धि के बराबर होने दें।
    1. बैकअप के रूप में अतिरिक्त ट्रैबेकुला प्राप्त करने के लिए, इस समय अतिरिक्त ट्रैबेकुला को विच्छेदित करने के लिए चरण 3.7-3.8 दोहराएं।
  9. प्रायोगिक कक्ष में सुपरफ्यूजन और / या सक्शन की आपूर्ति करने वाले पंप को बंद कर दें। बड़े बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, ट्रेबेकुला को टाइरोड के समाधान से भरे प्रयोगात्मक कक्ष में ले जाएं।
  10. ट्रेबेकुला के अंत में ऊतक के एक >1 मिमी क्यूब टुकड़े को बल ट्रांसड्यूसर पर एक हुक में पिन करें, फिर दूसरे क्यूब को मोटर में पिन करें।
    नोट: ट्रांसड्यूसर तक बेहतर पहुंच के लिए पहली तरफ चढ़ते समय मोटर और फोर्स ट्रांसड्यूसर को अलग करें, फिर ऊतक के दूसरे घन को माउंट करते समय हुक को यथासंभव करीब ले जाएं, जबकि ट्रेबेकुला सुस्त रहता है।
  11. सुपरफ्यूजन को पुनरारंभ करें और थ्रेशोल्ड वोल्टेज निर्धारित करने के लिए मांसपेशियों को पेस करना शुरू करें। ट्रेबेकुला को बराबर करने की अनुमति देने के लिए लगभग 1 घंटे के लिए थ्रेशोल्ड वोल्टेज से 20% ऊपर गति करें।
  12. इस संतुलन अवधि के अंत में, विकसित (न्यूनतम से चरम) तनाव को देखकर मोटर से जुड़े माइक्रोमीटर का उपयोग करके मांसपेशियों को धीरे-धीरे फैलाएं जब तक कि इष्टतम विकसित तनाव उत्पादन प्राप्त न हो जाए। मांसपेशियों की लंबाई बढ़ाना बंद करें जब निष्क्रिय डायस्टोलिक तनाव चरम तनाव की तुलना में तेजी से बढ़ता है, यह दर्शाता है कि इष्टतम लंबाई पारित हो गई है।
  13. प्रेषित माइक्रोस्कोप रोशनी को बंद करें, और एक खड़ी कोण पर हंसनेक इलुमिनेटर का उपयोग करके ट्रेब्युकुला को रोशन करें। माइक्रोस्कोप ऑप्टिक्स के माध्यम से जुड़े कैमरे का उपयोग करके जिसे पहले कैलिब्रेट किया गया है, प्रयोगात्मक फ़ोल्डर में डायस्टोलिक के दौरान ट्रेबेकुला की एक छवि कैप्चर करें। यदि ट्रैबेकुला कैमरे के दृश्य क्षेत्र से अधिक चौड़ा है, तो मांसपेशियों में कई छवियां लें।
  14. पिक्सेल दूरी की रिपोर्ट करने वाले इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में छवि खोलें।
    1. मांसपेशियों के व्यास की पिक्सेल दूरी को इसकी लंबाई के साथ चार बार मापें। ऊतक के बड़े घन को छोड़कर, पिक्सेल में मांसपेशियों (ट्रैबकुला) की लंबाई को मापें।
    2. यदि मांसपेशियों की लंबाई दृश्य के क्षेत्र से अधिक है, तो पूरी लंबाई को मापने के लिए मांसपेशियों के साथ संदर्भ बिंदुओं का उपयोग करें।
  15. प्रयोगात्मक फ़ोल्डर में टेम्पलेट का उपयोग करके, व्यास माप को औसत करें, और पहले से प्राप्त अंशांकन का उपयोग करके व्यास और लंबाई को पिक्सेल से मिमी में परिवर्तित करें। क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र की गणना π* व्यास 2/4 मिमी2 मेंऔर मांसपेशियों की लंबाई μm में करें।

4. डेटा अधिग्रहण

  1. एक बार मांसपेशी के बराबर हो जाने के बाद, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें, प्रयोग ों का चयन करें | लंबाई नियंत्रण, और अंशांकन बॉक्स में कैलिब्रेटेड ट्रेबेकुला लंबाई (एफएल) और क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र (क्षेत्र [एम2]) दर्ज करें।
  2. टेम्पलेट फ़ोल्डर (चरण 1.7) से, सुनिश्चित करें कि freeform_file.txt सही फ़ोल्डर को इंगित करता है, और किसी पाठ संपादक में freeform.dap फ़ाइल खोलें। *.dap फ़ाइल में आइसोटोनिक स्तर (आइसोटन) को 32,000 पर सेट करें।
  3. लंबाई नियंत्रण बॉक्स में, Freeform टैब का चयन करें और उपयुक्त Freeform सूची फ़ाइल के लिए ब्राउज़ करें। सुनिश्चित करें कि डेटा फ़ाइलिंग पथ भी डेटा सहेजने के लिए सही फ़ोल्डर है। आनुपातिक और एकीकरण लाभ मापदंडों के साथ प्रतिक्रिया नियंत्रण का उपयोग करके लोड-क्लैंप डेटा प्राप्त करने से पहले, रन एक्सपीरियाटी दबाकर पूरी तरह से आइसोमेट्रिक स्विच से डेटा प्राप्त करना शुरू करें।
  4. *.dap फ़ाइल में आफ्टरलोड (आइसोटन) को परिभाषित करके लोड-क्लैंप डेटा प्राप्त करें, और पाठ संपादक में फ़ाइल को सहेजकर आनुपातिक लाभ (प्रोपगेन) और एकीकरण (Ki) मापदंडों के मानों को पुन: व्यवस्थित करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस में प्रयोग चलाएँ ।
    1. सुनिश्चित करें कि क्लैंप में तनाव दरों की अधिकतम सीमा प्राप्त करने के लिए इस पुनरावृत्ति के दौरान अपनी मूल लंबाई (कभी-कभी विश्राम लोडिंग5 के रूप में संदर्भित) पर वापस लम्बा करना शामिल है, मोड (एफएलस्विच) को एक से सेट करके और लोड-क्लैंप (फ्लेथ्रेसहोल्ड) को शून्य से समाप्त करने के लिए सीमा बढ़ाकर।
  5. मोड (flswitch) को एक से शून्य में बदलकर लोड-क्लैंप के अंत को नियंत्रित करें। लोड-क्लैंप के अंत को शून्य से पुन: लंबा करने के लिए बदलते समय अधिग्रहण को दोहराएं, ताकि शुरुआती लंबाई में वापस पुन: लंबा किया जा सके।
    1. लंबाई बढ़ाने के लिए, लोड-क्लैंप (फ्लेथ्रेसहोल्ड) को शून्य से समाप्त करने के लिए सीमा को क्रमिक रूप से बढ़ाएं जब तक कि मांसपेशी लगभग अपनी मूल लंबाई में वापस न आ जाए।
  6. मोड (flswitch = 1) और थ्रेशोल्ड (flsथ्रेशोल्ड = 0) को रीसेट करें, और एक अंतिम डेटा अधिग्रहण चलाएं।
  7. यदि वांछित हो, तो चरण 4.4-4.6 को दोहराकर अध्ययन में आफ्टरलोड को संशोधित करें। यह अधिग्रहण तुरंत किया जा सकता है।
  8. यदि वांछित हो, तो मांसपेशियों को खींचकर या छोटा करके प्रीलोड को संशोधित करें, या टाइरोड के समाधान में यौगिकों को जोड़कर मांसपेशियों का इलाज करें। यदि प्रीलोड को बदलना या यौगिकों को जोड़ना, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20 मिनट प्रतीक्षा करें कि धीमी गति से बल प्रतिक्रिया 9,15 स्थिर हो गई है और / या यौगिक को मांसपेशियों में पूरी तरह से प्रवेश करने के लिए।
  9. एक बार डेटा अधिग्रहण पूरा हो जाने के बाद, ट्रेबेकुला को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो जैव रासायनिक या हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए ट्रेबेकुला को फ्रीज या ठीक करें।
  10. कार्य क्षेत्रों और प्रयोगात्मक प्रणाली को साफ करें, सभी ट्यूबिंग को पानी से फ्लश करें, और सभी घटकों को बंद कर दें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. प्रोग्राम को उपयुक्त फ़ाइल पथ पर निर्देशित करके मात्रात्मक विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करके डेटा फ़ाइलों को खोलें।
  2. यह सुनिश्चित करके विश्राम की मात्रा निर्धारित करें कि डेटा विश्लेषण कार्यक्रम क्लैंप किए गए बीट का विश्लेषण करता है, और यह कि प्रोग्राम लोड-क्लैंप की शुरुआत को सही ढंग से प्राप्त करता है।
    1. सुनिश्चित करें कि लोड-क्लैंप के अंत की पहचान की जाती है, ताकि एक आइसोमेट्रिक विश्राम के दौरान तनाव के चरम नकारात्मक व्युत्पन्न से विश्राम दर (1/2) की मात्रा निर्धारित की जा सके।
    2. इस घातीय समय स्थिरांक, या विश्राम के अन्य उपयुक्त परिमाणीकरण (तनाव का न्यूनतम व्युत्पन्न, लॉजिस्टिक समय स्थिरांक17, या किनेमेटिक मॉडल18) निर्धारित करने के लिए ग्लैंट्ज़ विधि16 का उपयोग करें।
  3. सुनिश्चित करें कि डेटा विश्लेषण कार्यक्रम तनाव के समय व्युत्पन्न को लेकर तनाव दर की गणना करता है, जहां तनाव की गणना इष्टतम संकुचन पर लंबाई से विभाजित समय के कार्य के रूप में की जाती है।
  4. किसी दिए गए स्थिति के सभी निशान के लिए उपरोक्त चरणों को दोहराएं।
  5. विश्राम दर और तनाव दर के बीच संबंध को प्लॉट करें, अधिकतम डेटा को 1 एस -1 से कम की शारीरिक तनाव दर तक सीमित करें। कम तनाव दर (चित्रा 4 सी) पर डेटा को बाहर करें, क्योंकि छूट चरण घातीय क्षय17,18 को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है।
  6. छूट दर और तनाव दर के बीच रेखा की ढलान प्राप्त करें, और एमसीआर के सूचकांक के रूप में ढलान को रिकॉर्ड करें।
  7. पूछताछ की गई प्रत्येक स्थिति के लिए उपरोक्त विश्लेषण दोहराएं।

Representative Results

एक प्रतिनिधि डेटा सेट चित्रा 4 में दिखाया गया है, और अतिरिक्त परिणाम पूर्व प्रकाशनों 8,9 में पाए जासकते हैं। संक्षेप में, तनाव दर की गणना तनाव के व्युत्पन्न से की जाती है, आइसोमेट्रिक विश्राम से ठीक पहले। तनाव इष्टतम लंबाई पर मांसपेशियों की लंबाई से विभाजित समय के कार्य के रूप में लंबाई है। विश्राम दर की गणना 1/2 के रूप में की जाती है, जहां यह घातीय समय स्थिरांक16 है। छूट के यांत्रिक नियंत्रण (एमसीआर) को निर्धारित करने के लिए कई तनाव दरों और उनके परिणामी छूट दरों की आवश्यकता होती है। इन आंकड़ों को छूट दर बनाम तनाव दर ग्राफ पर प्लॉट किया गया है। लाइन की ढलान एमसीआर सूचकांक प्रदान करती है।

ध्यान दें कि अंत सिस्टोलिक और डायस्टोलिक तनाव दर 1 एस -1 से अधिक होने की संभावना नहीं है। इसलिए, ढलान में केवल 1 एस -1 < तनाव दर शामिल होनी चाहिए। कम तनाव दरों पर छूट दर को तनाव के न्यूनतम समय व्युत्पन्न (डीस्ट्रेस / डीटीमिन) में परिवर्तन से भ्रमित किया जा सकता है, और इन मामलों में, लगभग 0.15 एस -1 से कम स्ट्रेच के डेटा को अनदेखा किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: सकल विच्छेदन और हृदय प्रवेशनी क्षेत्र का सेटअप। दाएं से बाएं तक: ए। पशु के लिए संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष विच्छेदन क्षेत्र के पास स्थित है। b. वैकल्पिक वाष्पशील गैस स्कैवेंजर के लिए एक स्नॉर्कल। ग. एक विच्छेदन पैड, जहां जानवर को लापरवाह रखा जाएगा, को कृंतक को निरंतर संज्ञाहरण प्रदान करने के लिए (घड़ी के अनुसार) डी. नोजकोन द्वारा घेरा जाता है, जैसे हेमोस्टैट्स, एफ. सर्जिकल कैंची, जी. घुमावदार बारीक कैंची को प्रमुख (काटने) हाथ के साथ आसान पहुंच के लिए रखा जाता है, एच. घुमावदार आईरिस बल को गैर-प्रमुख हाथ से आसान पहुंच के लिए रखा जाता है। कृंतक के ऊपरी अंगों को टेप का उपयोग करके विच्छेदन पैड पर चिपकाया जा सकता है, और i. हृदय को कुल्ला करने के लिए छिड़काव समाधान के साथ एक विच्छेदन पकवान (या छोटा बीकर) पास में रखा जाना चाहिए। j. प्रवेशनी के लिए मंचित एक क्षेत्र पास में रखा जाना चाहिए। एक उपयुक्त प्रवेशनी के साथ एक सिरिंज एक रिंग स्टैंड पर लगाई जाती है। (इनसेट) 16 ग्राम प्रवेशनी की एक करीबी छवि, जिसमें 1 मिमी पीई 205 ट्यूबिंग जुड़ी हुई है और एक सीवन शिथिल रूप से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रायोगिक क्षेत्र और उपकरण। (ए) प्रायोगिक क्षेत्र। प्रायोगिक कक्ष और डेटा अधिग्रहण प्रणाली पास के उल्टे माइक्रोस्कोप (बाएं) पर तैयार की जाती है। ट्रेबेकुला अलगाव और माउंटिंग एक स्टीरियोस्कोप (दाएं) के तहत होता है। (बी) 10% बीएसए समाधान में भिगोकर दो फोर्स, बड़ी और छोटी वन्ना कैंची और एक कस्टम ग्लास प्रोब की युक्तियां तैयार की जाती हैं। (सी) अतिरिक्त विच्छेदन उपकरण। एक सिलिकॉन इलास्टोमर-प्लेटेड डिश ठीक विच्छेदन के दौरान दिल को बढ़ाने की अनुमति देता है। अंत कट के साथ एक 7 एमएल ट्रांसफर पिपेट डिश और ग्लास प्रोब के नीचे दिखाया गया है। ट्रांसफर पिपेट की कट टिप को त्याग दिया जाता है, और मांसपेशियों को स्थानांतरित करने के लिए एक बढ़े हुए बोर का उपयोग किया जाता है, जिसमें खिंचाव या निर्जलीकरण का न्यूनतम जोखिम होता है। (डी) एक ग्लास पिपेट के अंत की आवर्धित छवि, जो लगभग 2 मिमी लंबी और व्यास में 0.25-0.5 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विच्छेदन के लिए गाइड। (ए) सकल विच्छेदन त्वचा के माध्यम से एक अनुप्रस्थ कट (1. हरे) से शुरू होना चाहिए जो ज़ीफॉइड प्रक्रिया के नीचे पेरिटोनियल गुहा में होता है (निचली पसलियों और ज़ाइफॉइड को एक पतली ग्रे लाइन द्वारा इंगित किया जाता है)। पेरिटोनियल गुहा से रिबकेज तक पैरा-कट का पालन करना चाहिए (2. टील और 3. नीली रेखाएं), जिसके बाद डायाफ्राम को काटा जाना चाहिए। एक हेमोस्टैट का उपयोग तब ज़ाइफॉइड प्रक्रिया को दबाने और छाती की दीवार को सिर की ओर बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। (बी) एक बरकरार चूहे का दिल सिलिकॉन-इलास्टोमेर डिश पर पिन किया गया है, जो दाएं वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ (आरवीओटी), दाएं आलिंद (आरए), महाधमनी (एओ), और बाएं आलिंद (एलए) के दृश्य के साथ उन्मुख है। कटौती का पहला सेट आरवीओटी से सेप्टम (1) के साथ शीर्ष तक होना चाहिए। पीली रेखा)। कटौती का दूसरा सेट दिल के आधार के साथ आरवीओटी से होना चाहिए, फिर दाएं आलिंद (2. नारंगी रेखा) के पार। (सी) आरवीओटी को हृदय को खोलने और इसे वापस पिन करने के लिए महाधमनी से सावधानीपूर्वक खींचा जा सकता है। पीली और नारंगी रेखाएं बी में वर्णित कटौती के अनुरूप हैं। फ्री स्टैंडिंग ट्रेबेक्यूअक्सर आरवी मुक्त दीवार के आधार के पास और सेप्टम के पास पाए जाते हैं, लेकिन कहीं भी हो सकते हैं (लाल रेखाएं सामान्य स्थानों को इंगित करती हैं)। (डी) एक ट्रेबेकुला के तहत ग्लास प्रोब का आवर्धित दृश्य (पीला तीर ट्रेबेकुला और जांच के चौराहे को इंगित करता है)। (ई) एक ट्रेबेकुला (लाल तीर) को एक बल ट्रांसड्यूसर (बाएं) और मोटर (केंद्र-दाएं) के बीच प्रयोगात्मक प्रणाली में लगाया जाता है, और दो पेसिंग लीड (ट्रेब्युला के ऊपर और नीचे क्षैतिज) से घिरा होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि निशान और परिणाम । (ए) माइक्रोस्कोप लेंस की धुरी से एक खड़ी (~ 75 डिग्री) कोण पर एक हंसनेक एलईडी प्रकाश का उपयोग करके रोशन किया गया एक एकल कार्डियक ट्रेबेकुला, जो ट्रेबेकुला के कंट्रास्ट को बढ़ाता है। इस उदाहरण में, ट्रेब्युला की पूरी लंबाई दिखाने के लिए दो छवियों को टाइल किया गया है। (बी) एक ही ट्रैबेकुला के लिए तनाव-समय (ऊपर) और तनाव-समय (नीचे) वक्र। सिस्टोलिक तनाव दरों में वृद्धि पर तीन लोड-क्लैंप स्विच के साथ एक आइसोमेट्रिक ट्विच दिखाया गया है। (सी) प्रतिनिधि एमसीआर गणना। एमसीआर को छूट दर और तनाव दर के बीच की रेखा के ढलान के रूप में परिभाषित किया गया है। जैसा कि चर्चा में उल्लेख किया गया है, तनाव दरों को मात्रात्मक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एमसीआर प्रदान करने के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: समाधान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

विश्राम का यांत्रिक नियंत्रण (एमसीआर) मांसपेशियों की कार्यवाही छूट 8,9 की तनाव दर पर मायोकार्डियल छूट दर की निर्भरता को निर्धारित करता है। आफ्टरलोड के बजाय तनाव दर, छूट दर8 को संशोधित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त दोनों है। चूंकि कैल्शियम दर को संशोधित करने के लिए हस्तक्षेप कार्डियक विश्राम में काफी सुधार करने के लिए साबित नहीं हुए हैं, यांत्रिक हस्तक्षेप तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और डायस्टोलिक डिसफंक्शन के लिए एक नया उपचार प्रदान कर सकता है।

यहां वर्णित मायोकार्डियल तनाव दर को संशोधित करने के लिए प्रोटोकॉल एक आइसोटोनिक लोड-क्लैंप 8,9 का उपयोग करता है। आइसोटोनिक लोड-क्लैंप की एक ताकत आफ्टरलोड तनाव का मात्रात्मक नियंत्रण है। विंडकेसेल जैसे प्रोटोकॉल का उपयोग आफ्टरलोड, प्रीलोड और कार्डियक वर्क 2,6,7 में बदलाव की जांच के लिए किया जा सकता है। लोड-क्लैंप द्वारा नियंत्रित नहीं किए गए एक रैंप का उपयोग तनाव दर से तनाव में बदलाव को बेहतर ढंग से अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। भले ही, आफ्टरलोड स्वयं छूट दर8 का एक मजबूत संशोधक प्रतीत नहीं होता है।

प्रोटोकॉल को तापमान और पेसिंग दर के लिए अधिक शारीरिक स्थितियों तक पहुंचने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। एमसीआर की उपस्थिति दिखाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण का उपयोग किया गया था। प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर शारीरिक स्थितियों में प्रयोगों का संचालन आम तौर पर अनुशंसित है। हालांकि, 37 डिग्री सेल्सियस या उच्च पेसिंग दर पर किए गए प्रयोग, मांसपेशियों को रनडाउन (क्षति) को अधिक तेजी से प्रेरित कर सकते हैं। बेहतर ऑक्सीजन वहन क्षमता वाले समाधान की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, डेटा अधिग्रहण तेजी से स्विच को हल करने और प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रदान करने के लिए लंबाई और बल का तेजी से नमूना लेने में सक्षम होना चाहिए।

वर्तमान प्रोटोकॉल कैल्शियम के माप या सरकोमेरे लंबाई के माप और नियंत्रण का वर्णन नहीं करता है। कैल्शियम माप को अन्य प्रोटोकॉल11 में संबोधित किया गया है, जबकि सार्कोमेरे लंबाई माप को उचित उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है। वर्तमान एमसीआर अध्ययनों में सरकोमेरे लंबाई नियंत्रण का उपयोग नहीं किया जाता है, क्योंकि मांसपेशियों की लंबाई नैदानिक स्थिति19 के लिए सबसे अधिक सापेक्ष पैरामीटर है। इसके अलावा सरकोमेरे लंबाई नियंत्रण (बनाम मांसपेशियों की लंबाई नियंत्रण) गतिज प्रश्नों के विशिष्ट उत्तर प्रदान करेगा, लेकिन अंतर-सार्कोमेरे भिन्नता और विवो में सरकोमेरे लंबाई परिवर्तनों की न्यूनतम समझ के कारण ट्रांसलेशनल ज्ञान को जोड़ने की संभावना नहीं है।

डेटा की प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए यहां तीन प्रयोगात्मक विचारों पर प्रकाश डाला गया है।

सबसे पहले, कुछ जानवरों (अप्रकाशित परिणाम और संचार) में फ्री-स्टैंडिंग कार्डियक ट्रेबेक्यूले को ढूंढना मुश्किल हो सकता है। जबकि अधिकांश चूहों में चिकोटी की मांसपेशियां पाई जा सकती हैं, चूहों में ट्रेबेकुला से डेटा प्राप्त करने के लिए एक उचित सफलता दर तीन में से एक है। ब्राउन नॉर्वे एक्स लुईस एफ 1 चूहों के साथ ट्रैबेकुला की सफलता अधिक हो सकती है, जिनका उपयोग ऐतिहासिक रूप से20 बार भी किया गया है और अधिक ट्रैबेक्यूले (अप्रकाशित संचार) होने की सूचना मिली है। चूहों के लिए, सफलता दर कम होने की संभावना है, बीएल / 6 पृष्ठभूमि से चूहों के लिए 10 में से एक से कम की उम्मीद है; हालांकि, एफवीबीएन पृष्ठभूमि (अप्रकाशित संचार और अवलोकन) से चूहों के लिए एक उच्च दर की उम्मीद है।

दूसरा, मांसपेशियों को नुकसान आउटपुट को कम कर सकता है। यदि विकसित बल 25 डिग्री सेल्सियस और 0.5 हर्ट्ज पेसिंग पर 10 mN mm-2 से कम हैं, तो जांचकर्ताओं को यह आकलन करने के लिए समस्या निवारण करने की आवश्यकता हो सकती है कि क्या धातु बल और मांसपेशियों के बीच अनजाने में खिंचाव या संपर्क हो रहा है, यदि समाधान ठीक से तैयार नहीं किए गए हैं, या यदि पेसिंग या प्रयोगात्मक उपकरण ठीक से काम कर रहे हैं। बरकरार ट्रेबेकुला का उपयोग करने वाले अन्य प्रोटोकॉल ने स्थानांतरण जहाजों11 के रूप में लुएर-लॉक सिरिंज का उपयोग करने का सुझाव दिया है। हालांकि यह संभव है, खासकर यदि उपयोगकर्ता बहुत धीमी प्रवाह दर या छोटे मांसपेशी खंड को नियंत्रित करता है, तो वर्तमान प्रोटोकॉल संभावित क्षति को कम करने के लिए बहुत बड़े बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करता है। एक और कदम जहां इस्केमिक क्षति हो सकती है वह विच्छेदन के दौरान है। कार्डियोमायोसाइट्स आइसोलेशन प्रोटोकॉल21,22 में सूचीबद्ध सीमाओं के समान, महाधमनी को पहले पेट के कट (चूहे) या ग्रीवा अव्यवस्था (माउस) के 3 मिनट के भीतर छिड़काव समाधान के साथ प्रवेशित और फ्लश किया जाना चाहिए। यह उस समय को कम करता है जब हृदय के ऊतक कार्डियोप्लेजिया जैसे छिड़काव समाधान के संपर्क में नहीं आते हैं। इसके अलावा, 30 मिनट से अधिक समय तक चलने वाले विच्छेदन आम तौर पर ट्विचिंग ट्रेबेकुला का उत्पादन नहीं करते हैं। इस प्रकार, ऑपरेटरों को क्षति को कम करने के लिए तेजी से लेकिन सावधानीपूर्वक विच्छेदन का अभ्यास करना चाहिए। 0.2 मिमी 2 (2 x 10-7 मीटर2) से ऊपर एक क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र कोर इस्किमिया20 से पीड़ित हो सकता है।

तीसरा, जिस तरह से मांसपेशियों को मोटर और बल ट्रांसड्यूसर से जोड़ा जाता है, उस पर विचार किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल वर्तमान में हुक और फ्री-स्टैंडिंग ट्रेबेक्यूले पर केंद्रित है। विश्राम से पहले खिंचाव की कभी-कभी तीव्र तनाव दर एक मांसपेशी को स्लाइड करने का कारण बन सकती है यदि ठीक से चिपकाया नहीं जाता है, यही कारण है कि वर्तमान प्रोटोकॉल ट्रैबेकुला23,24 को पकड़ने के लिए "टोकरी" का उपयोग नहीं करता है। वैकल्पिक माउंटिंग विधियों (चिपकने वाला, क्लिप, आदि25,26) पर भी विचार किया जा सकता है और मान्य किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल ट्रेबेक्यूले का उपयोग करता है और पैपिलरी मांसपेशियों का नहीं। पैपिलरी मांसपेशी का कॉर्डे एक श्रृंखला लोच को प्रेरित करता है जो एमसीआर9 में परिवर्तन को रोक सकता है। हालांकि, मांसपेशियों में संलग्नक का सटीक प्लेसमेंट उपायों को प्रभावित करने की संभावना नहीं है, क्योंकि ट्रेबेकुला लंबाई (और व्यास) काफी भिन्न होती है।

हुक के साथ मांसपेशियों के सिरों को छेदने की एक सीमा यह है कि माउंटिंग पॉइंट भी क्षतिग्रस्त हो सकता है। लगातार संकुचन (उनकी ताकत के आधार पर) के साथ चिपके हुए मांसपेशी ऊतक का संभावित फटना लंबाई या श्रृंखला लोच को बदल सकता है। फाड़ने की इस दर को नियंत्रित करना मुश्किल है। इसी तरह, खिंचाव के दौरान ऊतक और हुक को नुकसान बढ़ सकता है, संभावित रूप से समस्याएं भी पैदा कर सकता है। दृश्य निरीक्षण, और समतुल्य आइसोमेट्रिक बल के शेष >80% विकसित बल मूल्यों का उपयोग यह आकलन करने के लिए किया जाना चाहिए कि क्या तैयारी क्षतिग्रस्त है और इसे बाहर रखा जाना चाहिए।

एक और सीमा या विचार प्रभावित करता है कि विधि द्वारा किन प्रयोगात्मक प्रश्नों का उत्तर दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छिड़काव समाधान में 2,3-ब्यूटेनडियोन मोनोक्सीम (बीडीएम) के उपयोग पर विचार करें। बीडीएम एक फॉस्फेट है, जो मांसपेशियों के कार्य को बदल सकता है। इसके अलावा, अनलोडिंग की लंबी अवधि और पेसिंग की कमी का मतलब है कि अव्यक्त फॉस्फोराइलेशन स्थिति संभवतः बदल गई है। इस प्रकार, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए यदि किसी जानवर की मांसपेशियों की सिकुड़न (बनाम जीनोटाइप या उपचार के बीच अंतर) का सीधे आकलन करने की कोशिश की जाती है, क्योंकि सिकुड़ा हुआ राज्य संभवतः बदल गया है। हालांकि, फॉस्फोराइलेशन के प्रभाव का मूल्यांकन मार्ग के एगोनिस्ट या विरोधी को जोड़कर औषधीय रूप से किया जा सकता है।

सारांश में, एमसीआर इस बात की जानकारी प्रदान करता है कि मांसपेशियों की गति (तनाव दर) द्वारा विश्राम को कैसे नियंत्रित किया जाता है। एमसीआर डायस्टोलिक रोग के निदान और निगरानी में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है, साथ ही औषधीय हस्तक्षेप के लिए लक्ष्य, जैसे कि मायोसिन कैनेटीक्स को संशोधित करना। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल और सलाह कई वर्षों के परीक्षणों में विकसित ज्ञान को बताती है, और हृदय रोग के अन्य प्रणालियों और मॉडलों पर लागू होनी चाहिए।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R01HL151738) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (18TPA34170169) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 or 16 gauge blunted needle/canula for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop
2,3-Butanedione Monoxime Sigma-Aldrich B0753-25G
23 gauge blunted needle/canula for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop
5 mL syringe BD Luer-Lock 309646
95% Oxygen/5% CO2 AirGas Z02OX9522000043
Anethesia system EZ Systems EZ-SA800 Can use any appropriate anethesia method/system
Bovine Serum Albumin Fisher BioReagents BP-1600 to coat tips of fine forcepts, scissors
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Chemical C79-500
Containers/dissection dishes FisherBrand 08-732-113 Weigh dishes for creating dissection plates
Crile Hemostat Fine Science Tools 13005-14 for mouse gross dissection
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Data acquisition software SLControl
Data acquisition system MicrostarLabs DAP5216a Can use any DAQ.  This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot
Data analysis software Mathworks Matlab Custom Script
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 2x for cannulation of aorta
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11254-20 2x for trabecula isolation
Experimental system Aurora Scientific 801C Can use any appropriate experimental chamber with force and length control
Fine Scissors, curved Fine Science Tools 14061-09 for removal of heart
Gooseneck Piggyback Illuminator AmScope LED-6WA
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Imaging software IrfanView
Iris Forceps World Precision Instruments 15915 for removal of heart
Isoflurane VetOne 502017
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma-Aldrich M2670-100G
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506-500G
Mayo Scissors Fine Science Tools 14110-15 for rat gross dissection
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14116-14 for mouse gross dissection
Microscope connected camera Flir BFS-U3-27S5M-C Includes acquisition software
Microscope/digital imaging system Olympus IX-73 Can use any appropriate microscope.  Needed to measure muscle length, cross sectional area
Mounting Pin/Needle BD PrecisionGlide 305136 For holding heart to dish.  27 G x 1-1/4
Mounting Pin/Needle Fine Science Tools 26000-40 For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)
Oxygen (O2) AirGas OX USP300
Peristaltic Pump Rainin Rabbit Can be any means to create flow in experimental chamber
pH and Oxygen sensor Mettler Toledo SevenGo pH and DO
Potassium Bicarbonate Sigma-Aldrich 237205-100G
Potassium Chloride Fisher Chemical P217-500
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich 795488-500G
Rochester-pean Hemostat World Precision Instruments 501708 for rat gross dissection
Silk Suture, Size: 4/0 Fine Science Tools 18020-40 cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1KG
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S7907-100G
Stereomicroscope AmScope SM-1TX
Student Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools 91500-09 for opening of the RV
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base Dow Corning 3097358-1004 For creating dissection plates
Syringe Holder Harbor Frieght Helping Hands 60501 Can be used as alternate for ring stand
Taurine Sigma-Aldrich T0625-1KG
Transfer Pipette FisherBrand 13-711-7M cut ~1" from tip to widen bore
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 for trabecula isolation

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References

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बरकरार कार्डियक ट्रेबेक्यूले का उपयोग करके विश्राम का यांत्रिक नियंत्रण
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Bukowski, M. J., Cavanaugh, B., Abbo, A., Chung, C. S. Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae. J. Vis. Exp. (192), e64879, doi:10.3791/64879 (2023).

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