Summary
빠른 심근 및 심장 이완은 정상적인 생리학에 필수적입니다. 기계적 이완 메커니즘은 이제 변형률에 의존하는 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 이완의 기계적 제어를 추가로 연구하기 위한 실험의 획득 및 분석에 대한 개요를 제공합니다.
Abstract
이완기 기능 장애는 심혈관 질환 증상에서 흔히 볼 수 있는 표현형입니다. 심장 경직 상승 (좌심실 이완기 말 압력 상승) 외에도 손상된 심장 이완은 이완기 기능 장애의 주요 진단 지표입니다. 이완은 세포질 칼슘의 제거와 근섬유 얇은 필라멘트의 비활성화를 필요로 하지만, 이러한 메커니즘을 표적으로 삼는 것은 아직 효과적인 치료법을 제공하지 못했습니다. 혈압(즉, 후부하)과 같은 기계적 메커니즘은 이완을 수정하기 위해 이론화되었습니다. 최근에, 우리는 심근 조직의 후속 이완 속도를 수정하기 위해 후부하가 아닌 스트레칭의 변형률을 수정하는 것이 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 이완의 기계적 제어(MCR)라고 하는 이완의 변형률 의존성은 온전한 심장 섬유주를 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 작은 동물 모델의 준비, 실험 시스템 및 챔버, 심장의 격리 및 섬유주의 후속 분리, 실험 챔버의 준비, 실험 및 분석 프로토콜을 설명합니다. 온전한 심장에서 변형이 길어진다는 증거는 MCR이 온전한 근육의 근섬유 동역학을 평가하는 방법과 함께 약리학적 치료의 더 나은 특성화를 위한 새로운 영역을 제공할 수 있음을 시사합니다. 따라서 MCR을 연구하면 심부전 치료의 새로운 접근 방식과 새로운 개척지로 가는 길을 밝힐 수 있습니다.
Introduction
심장 이완은 거의 모든 형태의 심부전(박출률이 감소한 심부전 포함)과 많은 심혈관 질환에서 손상됩니다. 투과된 근육에서 심장 기능을 평가하는 수많은 방법 외에도 온전한 심장 근육의 평가가 관심을 받고 있습니다. 이러한 조직은 하중이 가해지지 않은 상태(수축이 자유로운 끝) 또는 하중(길이 또는 힘 제어)으로 평가됩니다. 역사적으로, 온전한 분리된 근세포는 수축 중에 세포체가 자유롭게 짧아지는 무부하 상태에서 평가되었습니다. 온전한 심장 섬유주는 종종 길이가 변할 수 없지만 응력(단면적당 힘)이 생성되는 등척성 조건에서 평가됩니다. 손상되지 않은 근세포와 섬유주 방법 모두 하중 1,2의 수정으로 수렴하기 시작합니다.
근육에 하중을 가하기 위한 프로토콜(즉, 생리학적 후하중을 시뮬레이션하는 지정된 값에서 근육의 발달된 응력을 제어)은 수십 년에 걸쳐 개발되었습니다 3,4,5. 손상되지 않은 심장 조직에서로드 클램프를 사용하면 연구자가 등장 성 또는 Windkessel과 같은 후 하중 6,7,8,9을 사용하여 생체 내 심장주기를 더 밀접하게 모방 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 MCR(즉, 완화 속도의 변형률 의존성)을 정량화하는 데 사용되는 데이터를 얻는 것입니다8,9.
MCR 프로토콜은 이전 작업에서 채택되었지만 이 프로토콜의 초점(손상되지 않은 심장 조직을 사용하는 유사한 프로토콜과 비교)은 이완을 수정하는 생체역학적 메커니즘에 있습니다. 하중 클램핑 3,4,5,7,10을 사용하는 여러 프로토콜과 Windkessel 모델 1,2,11에 초점을 맞춘 프로토콜이 있지만 이 프로토콜은 이완 전 스트레칭이 이완 속도를 수정하는 방법을 구체적으로 설명합니다. 우리는 이 조절이 원발기(proto-diato-period)8 동안에 발생한다는 것을 보여주었는데, 이 단계는 원래 위거스(Wiggers)가 12에 의해 기술된 단계이다. 정상적인 건강한 심장에서 심근은 대동맥 판막 폐쇄 전(즉, 등용적 이완 전)13 박출 동안 연장되는 긴장을 겪습니다. 이것은 근육이 늘어나기 시작할 때까지 후부하 제어 기간을 연장함으로써 모방됩니다. 임상적 증거에 따르면 이러한 연장은 질병 상태에서 약화되거나 소실될 수 있으며14, 수축기말 변형률의 변화의 의미와 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다. 박출률이 보존된 이완기 질환 및 심부전에 대한 희박한 치료 옵션을 감안할 때 MCR이 이완 장애의 기저에 있는 새로운 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있다고 가정합니다.
여기에 기술된 육안적 해부는 설치류에 초점을 맞추고 있지만, 섬유주 분리는 온전한 심장에서 수행할 수 있으며, 이전에는 인간의 심장 섬유주와 함께 사용되었다8. 유사하게, 데이터 획득 및 분석은 또한 심근세포 또는 다른 단리된 근육 유형(1,10)에 적용될 수 있다. 이 논의에는 이 방법에 대한 가능한 변경 및 적응에 대한 논평과 함께 척수9의 기계적 특성으로 인한 유두근 사용에 대한 주의와 같은 제한 사항이 포함된다.
Protocol
다음 프로토콜은 Wayne State University의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 여기에서 프로토콜은 설치류 실험 대상을 활용하기 위한 단계를 설명하지만 다른 모델 유기체에서 사용하도록 조정할 수 있습니다.
1. 준비
- 실험 대상을 획득하고 실험실에 적응할 수 있도록 합니다.
- 250 mL의 관류 용액 및 250 mL의 변형된 티로드 용액(표 1)을 각각 10-20 ppm의O2, pH 7.3으로 산소화하여 준비한다.
- 캐뉼라가 부착된 5mL 주사기를 준비합니다. 주사기에 관류 용액을 채 웁니다. 마우스의 경우 23G, 작거나 큰 쥐의 경우 각각 18G 또는 16G의 캐뉼라를 사용하십시오. 뭉툭한 바늘 끝에 1mm 길이의 폴리에틸렌(PE) 튜브를 밀어 넣어 대동맥이 묶인 후 캐뉼라에서 미끄러지는 것을 방지합니다.
- 해부 및 캐뉼레이션 영역의 완전한 준비(그림 1)
- 두 개의 깨끗한 계량 보트를 관류 용액으로 절반 이상 채웁니다. 캐뉼라 주위에 적어도 하나의 이중 루프 봉합사를 배치하여 캐뉼라의 끝을 관류 용액에 담그십시오. 바 클램프로 주사기를 제자리에 고정하십시오.
- 수술용 가위, 지혈제, 홍채 집게, 작은 구부러진 가위, #3 집게 2개를 쉽게 접근할 수 있도록 놓습니다.
- 실험 시스템 전체에 변형된 Tyrode의 용액을 프라이밍하고 순환시켜 실험 시스템(그림 2)을 준비합니다. 챔버가 완전히 가득 차고 안정적인지 확인하십시오.
- 힘 변환기, 길이 모터, 페이싱 시스템, 온도 제어 시스템 및 데이터 수집 컴퓨터를 포함한 모든 데이터 수집 상자를 켭니다.
- 현재 실험을 참조하는 데 필요한 *.dap 및 포인터 파일이 포함된 템플릿 폴더를 복사하고 이름을 바꿉니다. 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다.
- 섬유주 분리 도구(Vannas 가위, #5 또는 #55 겸자, 유리 프로브)의 팁을 초순수 또는 관류 용액의 10%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)에 담그고 금속을 단백질로 코팅하여 준비합니다(그림 2B).
참고: 해부 전에 전체 실험 시스템을 준비해야 합니다.
2. 심한 해부 및 캐뉼러 삽입
- 동물 피험자의 식별, 체중 및 기타 관련 정보를 기록합니다.
- 선택적으로 안락사 최소 10분 전에 복강내 주사를 통해 설치류에 멸균 식염수에 헤파린 1,000U/kg을 주사하여 관상동맥 관류 전 응고 위험을 최소화합니다.
- 동물을 유도실에 넣고 표준 절차에 따라 100% 산소에서 기화된 3%-5% 이소플루란을 사용하여 전신 마취를 유도합니다.
알림: 이소플루란에 대한 노출을 최소화하는 데 사용되는 외부 청소부, 다운 드래프트 테이블 또는 흄 후드를 켭니다. - 설치류가 교정 반사를 잃고 호흡 속도가 느려지면 :
- (쥐의 경우) 유도실에서 동물을 꺼내 해부 패드에 앙와위 놓고 코 콘을 통해 계속 마취합니다.
- (마우스의 경우) 유도 챔버로부터 동물을 제거한 직후 자궁 경부 탈구를 수행한다. 노즈 콘은 필요하지 않습니다. 이소플루란 기화기를 0%로 돌립니다.
- 필요한 경우 동물에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 핀으로 지지되는 테이프를 사용하여 설치류의 상지를 흉벽에서 떨어진 해부 패드에 부착합니다. 해부를 진행하기 전에 적절한 마취 깊이(발가락 꼬집 반응 부족)를 확인하십시오.
- 자이포성 과정 바로 아래에 있는 수술용 가위(쥐의 경우 Mayo, 생쥐의 경우 Metzenbaum)를 사용하여 설치류의 복부 전체 너비를 가로질러 복막 공간으로 피부를 가로질러 자릅니다.
- 수술 용 가위를 사용하여 가로 절단에서 흉벽의 왼쪽과 오른쪽 모두에 두 개의 수직 절단 parasagittal (흉벽의 측면 위로)을 만듭니다. 그런 다음 횡격막을 가로질러 절단하여 시상 주위 절단을 연결하고 흉부 공간을 확보합니다.
- 설치류의 머리 쪽으로 지혈제를 사용하여 자염돌기를 고정하고 들어 올려 흉골과 흉벽을 설치류의 머리 쪽으로 움직여 흉부 공간과 심장을 노출시킵니다. 필요한 경우 시상주위 절개를 두 번째 척추 공간 근처로 빠르게 확장하여 심장을 완전히 노출시키거나 심낭 막을 파괴합니다.
- 구부러진 홍채 집게를 사용하여 심장을 조심스럽게 들어 올려 큰 혈관을 시각화합니다. 심근과 설치류의 척추 사이에 집게를 놓고 더 큰 혈관을 조이고 심방 또는 심실 부분을 조이지 않도록주의하면서 심장을 들어 올리십시오.
- 심장을 약간 들어 올리면서 구부러진 홍채 집게와 설치류의 척추 사이에 구부러진 홍채 가위 (오목한 부분)를 빠르게 놓고 큰 혈관과 폐를 심장에서 잘라냅니다. 신선한 관류 용액이 들어 있는 계량 보트나 비커에 심장을 빠르게 옮기고 흔들어 심장에서 혈액을 제거합니다.
- 이소플루란 기화기를 아직 완료하지 않은 경우 0%로 돌립니다. 폐, 심낭 또는 기타 조직의 큰 부분이 심장에 붙어 있는 경우 캐뉼라 삽입 간섭을 최소화하기 위해 이 때 조심스럽게 잘라내어 버리십시오.
- 구부러진 홍채 집게를 사용하여 준비된 캐뉼라를 물에 담근 상태에서 심장을 깨끗한 계량 보트 또는 비커로 옮깁니다. 대동맥을 캐뉼러하고 고리가 있는 실크 봉합사를 조여 대동맥을 고정하고 최대 5mL의 관류 용액으로 씻어냅니다.
- 캐뉼라에서 심장을 제거하고 실리콘 엘라스토머 코팅 계량 접시에 넣어 섬유주 분리를 준비합니다.
3. 섬유주의 격리 및 평형
- 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 심장을 넣고 실체 현미경으로 비춥니다.
- 우심실 유출로를 찾습니다. 좌심방과 심실 정점을 접시의 실리콘 엘라스토머에 고정합니다.
- 긴 Vannas 가위를 사용하여 우심실 유출로에서 중격을 따라 정점까지 자릅니다. 우심실 유출로에서 대동맥 근처의 우심방으로 절개한 다음 우심방을 절단합니다(그림 3B).
- 집게를 사용하여 조직이 늘어나지 않도록 주의하면서 유출로에서 우심실(RV) 자유 벽을 조심스럽게 당겨 엽니다.
참고: 실험자는 걱정 없이 절단할 수 있는 얇고 흰색 결합 조직 가닥을 찾을 수 있습니다. 더 큰 분홍색(조직) 색상의 가닥은 분리할 수 있는 섬유주일 수 있으므로 주의해서 평가해야 합니다. - 우심실 삼각형의 자유 벽을 접시에 고정하여 우심실을 노출시킵니다(그림 3C).
- 얇은(직경 <500μm) 성형되었지만 끝이 날카롭지 않은 유리 피펫을 사용하여 노출된 심내막에서 독립형 섬유주를 검색합니다(그림 3C).
참고: 독립형 섬유주는 그 아래를 완전히 조사할 수 있는 근육 조각입니다. 평행 한면 (일정한 너비)을 가진 섬유주를 사용하여 삼각형 유두 근육을 피하십시오. 이 과정과 후속 해부 과정에서 섬유주에 변형을 가하면 손상되어 전개된 힘이 감소할 수 있으므로 주의하십시오. - 작은 Vannas 가위를 사용하여 섬유주를 해부합니다. 부착을 위해 섬유주의 양쪽 끝에 ≥1mm 입방체의 조직 조각을 남겨 둡니다. 가능하면 섬유주를 늘리지 말고 금속 도구의 접촉을 최소화하십시오. 식별된 섬유주 근처 근육의 긴장을 최소화하기 위해 필요에 따라 심장을 고정하는 핀을 재배치합니다.
- 2mL 이송 피펫의 끝에서 ~7인치를 자르고 섬유주를 피펫에 천천히 끌어들인 다음 50% 관류 용액과 50% 변형된 Tyrode 용액이 들어 있는 새 계량 접시에 옮깁니다. 근육이 몇 분 동안 혼합 용액 내에서 세포 외 칼슘의 증가와 평형을 이루도록 합니다.
- 3.7-3.8단계를 반복하여 이 시점에서 추가 섬유주를 해부하여 백업으로 추가 섬유주를 얻습니다.
- 실험 챔버에 과융합 및/또는 흡입을 공급하는 펌프를 끕니다. 대구경 이송 피펫을 사용하여 섬유주를 Tyrode의 용액으로 채워진 실험 챔버로 옮깁니다.
- 섬유주 끝에 있는 >1mm 정육면체 조직 조각을 힘 변환기의 고리에 고정한 다음 두 번째 정육면체를 모터에 고정합니다.
알림: 변환기에 더 잘 접근할 수 있도록 첫 번째 면을 장착할 때 모터와 힘 변환기를 분리한 다음 섬유주가 느슨한 상태에서 조직의 두 번째 큐브를 장착할 때 후크를 최대한 가깝게 이동합니다. - 과융합을 다시 시작하고 근육의 속도를 조절하여 임계 전압을 결정합니다. 섬유주가 평형을 이루도록 약 1시간 동안 임계 전압보다 20% 높은 속도로 진행합니다.
- 이 평형 기간이 끝나면 발달 된 (최소에서 최고조까지) 장력을 관찰하여 최적의 발달 스트레스 생성이 달성 될 때까지 모터에 연결된 마이크로 미터를 사용하여 근육을 천천히 스트레칭합니다. 수동적 이완기 장력이 최대 장력보다 빠르게 상승하여 최적의 길이가 통과되었음을 나타내는 근육 길이 증가를 중지하십시오.
- 투과된 현미경 조명을 끄고 구즈넥 조명기를 사용하여 가파른 각도로 섬유주를 비춥니다. 이전에 보정된 현미경 광학 장치를 통해 연결된 카메라를 사용하여 확장기 동안 섬유주의 이미지를 실험 폴더에 캡처합니다. 섬유주가 카메라의 시야보다 넓은 경우 근육을 가로질러 여러 이미지를 촬영합니다.
- 픽셀 거리를 보고하는 이미징 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
- 길이를 따라 근육 직경의 픽셀 거리를 4 번 측정합니다. 조직의 큰 입방체를 제외한 근육 (trabecula) 길이를 픽셀 단위로 측정하십시오.
- 근육 길이가 시야보다 길면 근육을 따라 기준점을 사용하여 전체 길이를 측정합니다.
- 실험 폴더의 템플릿을 사용하여 지름 측정값의 평균을 구하고 이전에 얻은 보정을 사용하여 지름과 길이를 픽셀에서 mm로 변환합니다. 단면적을 π*직경 2/4 in mm2로 계산하고 근육 길이를 μm 단위로 계산합니다.
4. 데이터 수집
- 근육이 평형을 이루면 데이터 수집 소프트웨어를 열고 실험 | 길이 제어를 선택하고 보정 상자에 보정된 섬유주 길이(FL)와 단면적(면적[m2])을 입력합니다.
- 템플릿 폴더(1.7단계)에서 freeform_file.txt 올바른 폴더를 가리키는지 확인하고 텍스트 편집기에서 freeform.dap 파일을 엽니다. *.dap 파일에서 등장성 수준(isoton)을 32,000으로 설정합니다.
- 길이 제어(Length Control) 상자에서 자유형(Freeform) 탭을 선택하고 적절한 자유형 목록 파일을 찾습니다. 데이터 파일링 경로도 데이터를 저장할 올바른 폴더인지 확인합니다. 비례 및 적분 이득 매개변수가 있는 피드백 컨트롤을 사용하여 로드 클램프 데이터를 수집하기 전에 Run Experiment를 눌러 완전 아이소메트릭 트위치에서 데이터 수집을 시작합니다.
- *.dap 파일에서 사후 하중(isoton)을 정의하여 하중 클램핑된 데이터를 수집하고, 텍스트 편집기에 파일을 저장하여 비례 이득(propgain) 및 적분(Ki) 파라미터의 값을 반복합니다. 데이터 수집 소프트웨어 인터페이스에서 Run Experiment 를 누릅니다.
- 모드(flswitch)를 1에서 설정하고 로드 클램프(flthreshold)를 종료하기 위한 임계값을 0에서 늘림으로써 변형률의 최대 범위를 달성하기 위해 이 반복 중에 클램프가 원래 길이(이완 하중5라고도 함)로 다시 늘어나는 것을 포함하는지 확인합니다.
- 모드(flswitch)를 1에서 0으로 변경하여 load-cl의 끝을 제어합니다.amp. 로드 cl을 변경하면서 수집을 반복합니다.amp 제로 재연장에서 시작 길이로 다시 연장을 완료합니다.
- 길이를 늘리려면 근육이 원래 길이로 거의 다시 늘어날 때까지 로드 클램프(flthreshold)를 종료하기 위한 임계값을 0에서 점진적으로 늘립니다.
- 모드(flswitch = 1) 및 임계값(flthreshold = 0)을 재설정하고 최종 데이터 수집을 한 번 실행합니다.
- 원하는 경우 4.4-4.6단계를 반복하여 스터디의 후하중을 수정합니다. 이 인수는 즉시 수행될 수 있습니다.
- 원하는 경우 근육을 늘리거나 줄여 예압을 수정하거나 Tyrode의 용액에 화합물을 추가하여 근육을 치료하십시오. 예압을 변경하거나 화합물을 추가하는 경우 저속 힘 응답20이 안정화되고 화합물이 근육에 완전히 침투할 때까지 최소 9,15분을 기다리십시오.
- 데이터 수집이 완료되면 섬유주를 제거합니다. 필요한 경우 생화학적 또는 조직학적 분석을 위해 섬유주를 동결하거나 고정합니다.
- 작업 영역과 실험 시스템을 청소하고 모든 튜브를 물로 세척하고 모든 구성 요소를 끕니다.
5. 데이터 분석
- 프로그램을 적절한 파일 경로로 보내 정량 분석 프로그램을 사용하여 데이터 파일을 엽니다.
- 데이터 분석 프로그램이 클램핑된 비트를 분석하고 프로그램이 부하 클램프의 시작을 올바르게 획득하는지 확인하여 이완을 정량화합니다.
- 로드 클램프의 끝이 식별되어 이완률(1/τ)이 등척성 이완 중 응력의 피크 음의 도함수에서 정량화되도록 합니다.
- Glantz 방법(16)을 사용하여 이 지수 시간 상수 또는 이완의 다른 적절한 정량화(응력의 최소 미분, 로지스틱 시간 상수 17 또는 운동학적 모델18)를 결정합니다.
- 데이터 분석 프로그램이 변형률의 시간 도함수를 사용하여 변형률 속도를 계산하는지 확인합니다. 여기서 변형률은 최적 수축에서 시간을 길이로 나눈 함수로 길이를 계산합니다.
- 주어진 조건의 모든 추적에 대해 위의 단계를 반복합니다.
- 이완 속도와 변형률 속도 사이의 관계를 플로팅하여 최대 데이터를 1 s-1 미만의 생리학적 변형률로 제한합니다. 낮은 변형률 속도(그림 4C)에서 데이터는 제외하는데, 이는 완화 단계가 지수 감쇠를 반영하지 않을 수 있기 때문입니다17,18.
- 이완률과 변형률 사이의 선의 기울기를 구하고 기울기를 MCR의 지수로 기록합니다.
- 조사된 각 조건에 대해 위의 분석을 반복합니다.
Representative Results
대표적인 데이터 세트가 도 4에 도시되어 있고, 추가적인 결과는 이전 간행물 8,9에서 발견될 수 있다. 간단히 말해서, 변형률은 등척성 이완 직전에 변형률의 도함수로부터 계산됩니다. 스트레인은 시간의 함수로서의 길이를 최적의 길이에서 근육의 길이로 나눈 값입니다. 이완률은 1/τ로 계산되며, 여기서 τ는 지수 시간 상수16입니다. 여러 변형률과 그에 따른 완화율은 완화의 기계적 제어(MCR)를 결정하는 데 필요합니다. 이 데이터는 완화율 대 변형률 그래프에 표시됩니다. 선의 기울기는 MCR 지수를 제공합니다.
수축기 말기 및 이완기 긴장률은 1초를 초과하지 않을 것입니다.-1. 따라서 기울기에는 변형률 1초-1< 것만 포함되어야 합니다. 낮은 변형률 속도에서의 완화 속도는 응력의 최소 시간 미분(dStress/dtmin)의 변화에 의해 혼동될 수 있으며, 이러한 경우 약 0.15s-1 미만의 스트레치 데이터는 무시될 수 있습니다.
그림 1: 육안 박리 및 심장 캐뉼라 삽입 영역 설정. 오른쪽에서 왼쪽으로: a. 동물을위한 마취 유도 챔버는 해부 영역 근처에 위치한다. b. 휘발성 가스 제거제(옵션)를 위한 스노클. c. 동물을 누운 자세로 놓을 해부 패드는 (시계 방향) 옆에 있습니다. d. 설치류에 지속적인 마취를 제공하기 위한 노즈콘, e. 지혈제, f. 수술용 가위, g. 주로 사용하는(절단) 손으로 쉽게 접근할 수 있도록 배치된 구부러진 미세 가위, h. 주로 사용하지 않는 손으로 쉽게 접근할 수 있도록 배치된 구부러진 홍채 집게. 설치류의 상지는 테이프를 사용하여 해부 패드에 부착할 수 있으며, i. 관류 용액이 담긴 해부 접시(또는 작은 비커)를 근처에 두어 심장을 헹구어야 합니다. j. 캐뉼러 삽입을 위해 준비된 구역을 근처에 배치해야합니다. 적절한 캐뉼라가있는 주사기가 링 스탠드에 장착됩니다. k. (삽입) 16mm의 PE1 튜브가 부착되고 봉합사가 느슨하게 매듭이 있는 205G 캐뉼라의 더 가까운 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 실험 영역 및 도구. (A) 실험 영역. 실험 챔버와 데이터 수집 시스템은 근처의 도립 현미경(왼쪽)에서 준비됩니다. Trabecula 격리 및 장착은 입체경 (오른쪽)에서 발생합니다. (B) 두 개의 집게, 크고 작은 Vannas 가위, 맞춤형 유리 프로브의 팁은 10% BSA 용액에 담가서 준비합니다. (C) 추가 해부 도구. 실리콘 엘라스토머 도금 접시를 사용하면 미세 해부 중에 심장을 장착할 수 있습니다. 끝 절단이 있는 7mL 이송 피펫이 접시와 유리 프로브 아래에 표시됩니다. 이송 피펫의 절단 팁은 폐기되고 확대 된 보어는 스트레칭이나 탈수의 위험을 최소화하면서 근육을 이송하는 데 사용됩니다. (D) 길이가 약 2mm이고 직경이 0.25-0.5mm인 유리 피펫 끝의 확대 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 해부 가이드 . (A) 육안 절개는 피부를 통해 자이푸스 돌기 아래의 복강으로 가로 절단(1. 녹색)으로 시작해야 합니다(아래쪽 갈비뼈와 자염은 가는 회색 선으로 표시됨). 복강에서 흉곽 위로 시상 주위 절단이 따라야하며 (2. 청록색 및 3. 파란색 선) 횡격막을 절단해야합니다. 그런 다음 지혈제를 사용하여 자이푸스 과정을 고정하고 흉벽을 머리 쪽으로 올릴 수 있습니다. (B) 우심실 유출관(RVOT), 우심방(RA), 대동맥(Ao) 및 좌심방(LA)을 볼 수 있도록 방향이 지정된 실리콘 엘라스토머 접시에 고정된 손상되지 않은 쥐 심장. 첫 번째 절단 세트는 RVOT에서 중격을 따라 정점까지 이루어져야 합니다(1. 노란색 선). 두 번째 절단 세트는 RVOT에서 심장 기저부를 따라 우심방(2. 주황색 선)을 가로질러 이루어져야 합니다. (C) RVOT를 대동맥에서 조심스럽게 당겨 심장을 열고 다시 고정할 수 있습니다. 노란색과 주황색 선은 B에 설명된 컷에 해당합니다. 프리 스탠딩 섬유주는 종종 RV 프리 벽의 바닥 근처와 중격 근처에서 발견되지만 어디에서나 발생할 수 있습니다(빨간색 선은 일반적인 위치를 나타냄). (D) 확대 view 섬유주 아래 유리 탐침(노란색 화살표는 섬유주와 탐침의 교차점을 나타냄). (E) 섬유주(빨간색 화살표)는 힘 변환기(왼쪽)와 모터(중앙 오른쪽) 사이의 실험 시스템에 장착되고 두 개의 페이싱 리드(섬유주 위와 아래 수평)가 측면에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 추적 및 결과 . (A) 현미경 렌즈 축에서 가파른(~75°) 각도로 구즈넥 LED 조명을 사용하여 조명된 단일 심장 섬유주로, 섬유주의 대비를 향상시킵니다. 이 예에서는 섬유주의 전체 길이를 표시하기 위해 두 개의 이미지가 바둑판식으로 배열되어 있습니다. (B) 동일한 섬유주에 대한 응력-시간(위) 및 변형-시간(아래) 곡선. 말단 수축기 변형률이 증가하는 3개의 load-clamp 경련과 함께 등척성 경련이 표시됩니다. (C) 대표적인 MCR 계산. MCR은 완화 속도와 변형률 사이의 선의 기울기로 정의됩니다. 논의에서 언급했듯이 변형률은 정량적이고 재현 가능한 MCR을 제공하기 위해 제한될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 솔루션. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이완의 기계적 제어(MCR)는 근육 진행 이완의 변형률에 대한 심근 이완율의 의존성을 정량화한다 8,9. 후부하가 아닌 변형률 속도는 완화율(relaxation rate)8을 수정하는 데 필요하고 충분하다. 칼슘 비율을 수정하기 위한 중재가 심장 이완을 실질적으로 개선하는 것으로 입증되지 않았기 때문에 기계적 중재는 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 이완기 기능 장애에 대한 새로운 치료법을 제공할 수 있습니다.
여기에 기술된 심근 변형률을 변형시키기 위한 프로토콜은 등장성 로드-클램프 8,9를 이용한다. 등장성 하중 클램프의 강도는 후부하 응력의 정량적 제어입니다. Windkessel과 같은 프로토콜은 후부하, 예압 및 심장 작업 2,6,7의 변화를 추가로 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 로드 클램프에 의해 제어되지 않는 램프는 변형률 변화와 변형률 속도를 더 잘 분리하는 데 사용할 수도 있습니다. 그럼에도 불구하고, 후하중 자체는 이완률(relaxation rate)8의 강력한 조절자가 아닌 것으로 보인다.
프로토콜은 또한 온도 및 페이싱 속도에 대해 보다 생리적인 조건에 접근하도록 조정될 수 있습니다. 현재 프로토콜 세부 정보는 MCR의 존재를 표시하는 데 사용되었습니다. 실험 질문에 따라 생리적 조건에서 실험을 수행하는 것이 일반적으로 권장됩니다. 그러나 37°C 또는 빠른 페이싱 속도에서 수행된 실험은 근육에 더 빠르게 런다운(손상)을 유도할 수 있습니다. 산소 운반 능력이 향상된 솔루션이 필요할 수 있습니다. 또한 데이터 수집은 빠른 경련을 해결하고 피드백 제어를 제공할 수 있을 만큼 충분히 빠르게 길이와 힘을 샘플링할 수 있어야 합니다.
현재 프로토콜은 칼슘 측정 또는 육종 길이의 측정 및 제어를 설명하지 않습니다. 칼슘 측정은 다른 프로토콜(11)에서 다루어졌지만, 육종 길이 측정은 적절한 장비로 추가될 수 있다. 근육 길이가 임상 상태와 가장 상관관계가 있는 매개변수이기 때문에 현재 MCR 연구에서는 근관 길이 조절이 활용되지 않는다19. 추가 근관 길이 조절(vs. 근육 길이 조절)은 운동학적 질문에 대한 구체적인 답변을 제공할 것이지만, 근관 간 변이와 생체 내 근관 길이 변화에 대한 최소한의 이해로 인해 번역 지식에 추가되지 않을 것입니다.
여기서는 데이터의 재현성을 높이기 위해 세 가지 실험적 고려 사항을 강조합니다.
첫째, 독립형 심장 섬유주는 일부 동물에서 찾기 어려울 수 있습니다(미공개 결과 및 커뮤니케이션). 경련 근육은 대부분의 쥐에서 발견될 수 있지만 쥐의 섬유주에서 데이터를 얻는 합리적인 성공률은 3분의 1입니다. Trabecula의 성공은 Brown Norway x Lewis F1 쥐에서 더 높을 수 있으며, 이는 역사적으로20 마리 사용되었으며 더 많은 trabeculae (미공개 통신)를 가지고 있는 것으로 보고되었습니다. 마우스의 경우 성공률이 더 낮을 가능성이 높으며 BL/6 배경의 마우스의 경우 10명 중 1명 미만이 예상됩니다. 그러나 FVBN 배경(미공개 통신 및 관찰)의 마우스에 대해 더 높은 비율이 예상됩니다.
둘째, 근육 손상은 출력을 감소시킬 수 있습니다. 전개된 힘이 25°C 및 0.5Hz 페이싱에서 10mN mm-2 미만인 경우 조사관은 금속 집게와 근육 사이의 부주의한 스트레칭 또는 접촉이 발생하는지, 솔루션이 제대로 준비되지 않았는지, 또는 페이싱 또는 실험 장비가 제대로 작동하는지 평가하기 위해 문제 해결을 수행해야 할 수 있습니다. 온전한 섬유주를 사용하는 다른 프로토콜은 Luer-lock 주사기를 이송 용기로 사용할 것을 제안했습니다11. 이것이 가능하지만, 특히 사용자가 매우 느린 유속 또는 더 작은 근육 세그먼트를 제어하는 경우, 현재 프로토콜은 가능한 손상을 최소화하기 위해 훨씬 더 큰 보어 이송 피펫을 사용합니다. 허혈성 손상이 발생할 수 있는 또 다른 단계는 해부 중입니다. 대동맥은 심근 세포 분리 프로토콜21,22에 나열된 한계와 유사하게 첫 번째 복부 절개(쥐) 또는 자궁경부 탈구(마우스) 후 3분 이내에 관류 용액으로 캐뉼러링하고 씻어내야 합니다. 이것은 심장 조직이 심정지 유사 관류 용액에 노출되지 않는 시간을 최소화합니다. 또한, 30분 이상 지속되는 해부는 일반적으로 경련성 섬유주를 생성하지 않습니다. 따라서 작업자는 손상을 최소화하기 위해 신속하지만 조심스럽게 해부해야 합니다. 0.2mm2 (2 x 10-7 m2) 이상의 단면적은 심허혈을 앓을 수 있다(20).
셋째, 근육이 모터와 힘 변환기에 부착되는 방식을 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 현재 후크 및 독립형 섬유주에 중점을 둡니다. 이완 전에 스트레칭의 때때로 빠른 변형 속도는 적절하게 부착되지 않으면 근육이 미끄러지게 할 수 있으며, 이것이 현재 프로토콜이 섬유주를 고정하기 위해 "바구니"를 사용하지 않는 이유입니다(23,24). 대체 장착 방법(접착제, 클립 등,25,26)도 고려하고 검증할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 유두 근육이 아닌 섬유주를 사용합니다. 유두근의 척색은MCR9의 변화를 억제할 수 있는 일련의 탄력성을 유도한다. 그러나 섬유주 길이(및 직경)가 크게 다르기 때문에 근육에 부착물을 정확하게 배치하는 것은 측정에 영향을 미치지 않을 것입니다.
갈고리로 근육 끝을 뚫는 것의 한계는 장착 지점 자체도 손상될 수 있다는 것입니다. 빈번한 수축 (강도에 따라 다름)으로 부착 된 근육 조직이 찢어 질 수 있으면 길이 또는 일련의 탄력성이 변할 수 있습니다. 이 찢어짐 속도는 제어하기 어렵습니다. 마찬가지로, 스트레칭 중에 조직과 후크의 손상이 악화될 수 있으며 잠재적으로 문제를 일으킬 수도 있습니다. 육안 검사 및 평형 등척성 힘의 >80 %로 남아있는 전개 된 힘 값을 사용하여 제제가 손상되었는지 여부를 평가해야하며 제외해야합니다.
또 다른 제한 또는 고려 사항은 방법에 의해 답변될 수 있는 실험적 질문에 영향을 미친다. 예를 들어, 관류 용액에서 2,3-부탄디온 모노옥심(BDM)의 사용을 고려하십시오. BDM은 근육의 기능을 변화시킬 수 있는 포스파타제입니다. 또한, 장시간의 언로딩과 페이싱의 부족은 잠복 인산화 상태가 변했을 가능성이 있음을 의미합니다. 따라서 동물의 근육 수축성(유전자형 또는 치료법 간의 차이 비교)을 직접 평가하려는 경우 수축 상태가 변경되었을 가능성이 있으므로 주의해야 합니다. 그러나, 인산화의 영향은 상기 경로의 작용제 또는 길항제를 첨가함으로써 약리학적으로 평가될 수 있다.
요약하면, MCR은 이완이 근육 운동(변형률)에 의해 어떻게 조절되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. MCR은 미오신 동역학 수정과 같은 약리학적 개입 목표와 함께 이완기 질환의 진단 및 모니터링에 대한 더 나은 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에 요약된 프로토콜과 조언은 수년간의 시험을 통해 개발된 지식을 제시하며 심장 질환의 다른 시스템 및 모델에도 적용할 수 있어야 합니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
이 작업은 국립 보건원 (1R01HL151738)과 미국 심장 협회 (18TPA34170169)의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
| 5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Data acquisition software | SLControl | ||
| Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
| Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
| Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
| Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
| Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Imaging software | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
| Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
| Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
| Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
| Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
| Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
| pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
| Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
| Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
| Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |
References
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