Визуализация белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента с помощью иммунофлюоресцентных анализов
Summary
Настоящий протокол описывает методы оценки белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента. Сюда включены комплексные методы нанесения покрытия и окрашивания, а также подробные и объективные процедуры количественной оценки.
Abstract
Иммунофлуоресценция является одним из наиболее широко используемых методов визуализации антигенов-мишеней с высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, гликаны и малые молекулы. Хотя этот метод хорошо зарекомендовал себя в двумерной (2D) культуре клеток, меньше известно о его использовании в трехмерных (3D) моделях клеток. Органоиды рака яичников представляют собой 3D-модели опухолей, которые повторяют клональную гетерогенность опухолевых клеток, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клеточным матриксом. Таким образом, они превосходят клеточные линии по оценке лекарственной чувствительности и функциональных биомаркеров. Таким образом, способность использовать иммунофлуоресценцию на органоидах первичного рака яичников чрезвычайно полезна для понимания биологии этого рака. В настоящем исследовании описывается метод иммунофлуоресценции для обнаружения белков репарации повреждений ДНК в высокодифференцированных серозных органоидах рака яичников (PDO). После воздействия ионизирующего излучения на ЗОП проводят иммунофлуоресценцию на интактных органоидах для оценки ядерных белков как очагов. Изображения собираются с помощью визуализации z-stack на конфокальной микроскопии и анализируются с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета очагов. Описанные методы позволяют анализировать временную и специальную рекрутацию белков репарации повреждений ДНК и колокализацию этих белков с маркерами клеточного цикла.
Introduction
Рак яичников является основной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований. Большинство пациентов лечатся препаратами, повреждающими ДНК, такими как карбоплатин, а пациентам с гомологичными опухолями, дефицитными рекомбинационной репарацией (HRR), можно назначать ингибиторы поли (АДФ-рибозы) полимеразы (PARP) 1,2. Однако у большинства пациентов развивается резистентность к этим методам лечения, и они умирают в течение 5 лет после постановки диагноза. Нарушение регуляции ответа на повреждение ДНК (DDR) было связано с развитием рака яичников и резистентностью как к химиотерапии, так и к ингибиторам PARP3. Таким образом, изучение РДР необходимо для понимания патофизиологии рака яичников, потенциальных биомаркеров и новых таргетных методов лечения.
Современные методы оценки DDR используют иммунофлуоресценцию (IF), поскольку она позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, повреждающие ДНК, и аналоги нуклеотидов. Как только в ДНК происходит двухцепочечный разрыв (DSB), гистоновый белок H2AX быстро фосфорилируется, образуя очаг, в котором собираются белки репарации повреждений ДНК4. Это фосфорилирование можно легко идентифицировать с помощью IF; фактически, анализ ɣ-H2AX обычно используется для подтверждения индукции DSB 5,6,7,8,9. Повышенное повреждение ДНК было связано с чувствительностью платины и эффективностью повреждающих ДНК агентов 10,11,12, и ɣ-H2AX был предложен в качестве биомаркера, связанного с ответом на химиотерапию в других методах лечения рака 13. При DSB клетка, обладающая HRR, выполняет ряд событий, которые приводят к тому, что BRCA1 и BRCA2 рекрутируют RAD51 для замены репликационного белка A (RPA) и связывания с ДНК. Восстановление HRR использует шаблон ДНК для точного восстановления DSB. Однако, когда опухоли испытывают дефицит HRR, они полагаются на альтернативные пути репарации, такие как негомологичное соединение концов (NHEJ). Известно, что NHEJ подвержен ошибкам и создает высокую мутационную нагрузку на клетку, которая использует 53BP1 в качестве положительного регулятора14. Все эти белки, повреждающие ДНК, могут быть точно идентифицированы как очаги с помощью IF. В дополнение к окрашиванию белков, IF может быть использован для изучения защиты вилок и образования одноцепочечного разрыва ДНК. Способность иметь стабильные вилки коррелировала с ответом платины, и недавно анализы пробелов показали потенциал для прогнозирования ответа на ингибиторы PARP 6,15,16,17. Поэтому окрашивание на нуклеотидные аналоги после введения в геном является еще одним способом изучения ГДР.
На сегодняшний день оценка DDR при раке яичников была в значительной степени ограничена гомогенными 2D-клеточными линиями, которые не повторяют клональную гетерогенность, микроокружение или архитектуру опухолей in vivo 18,19. Недавние исследования показывают, что органоиды превосходят 2D-клеточные линии в изучении сложных биологических процессов, таких как механизмы DDR6. Настоящая методология оценивает RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA и геминин в PDO. Эти методы оценивают интактный органоид и позволяют изучать механизмы DDR в условиях, более похожих на микроокружение опухоли in vivo. Вместе с конфокальной микроскопией и автоматическим подсчетом очагов эта методология может помочь в понимании пути DDR при раке яичников и персонализации планов лечения для пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Реакция на повреждение ДНК играет неотъемлемую роль как в развитии рака яичников, так и в резистентности к химиотерапии. Поэтому необходимо глубокое понимание механизмов репарации ДНК. Здесь представлена методология изучения белков репарации повреждений ДНК в 3D-интактных органоидах….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Павлу Лобачевскому, доктору философии, за руководство в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета на кафедре акушерства и гинекологии Сент-Луиса и отделение гинекологической онкологии, Стипендиальную программу декана Вашингтонского университета, Фонд группы гинекологической онкологии и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
Materials
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O’Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
