Summary
APTrack è un plugin software sviluppato per la piattaforma Open Ephys che consente la visualizzazione dei dati in tempo reale e il monitoraggio della soglia elettrica a circuito chiuso dei potenziali d'azione neuronali. Abbiamo usato con successo questo in microneurografia per nocicettori umani in fibra C e nocicettori in fibra C e fibra Aδ di topo.
Abstract
I nocicettori sono una classe di neuroni afferenti primari che segnalano stimoli nocivi potenzialmente dannosi. Un aumento dell'eccitabilità dei nocicettori si verifica in condizioni di dolore acuto e cronico. Ciò produce un'attività in corso anomala o soglie di attivazione ridotte a stimoli nocivi. Identificare la causa di questa maggiore eccitabilità è necessario per lo sviluppo e la convalida di trattamenti basati sul meccanismo. Il tracciamento della soglia elettrica a singolo neurone può quantificare l'eccitabilità dei nocicettori. Pertanto, abbiamo sviluppato un'applicazione per consentire tali misurazioni e dimostrarne l'uso negli esseri umani e nei roditori. APTrack fornisce la visualizzazione dei dati in tempo reale e l'identificazione del potenziale d'azione utilizzando un grafico raster temporale. Gli algoritmi rilevano i potenziali d'azione superando la soglia e monitorano la loro latenza dopo la stimolazione elettrica. Il plugin modula quindi l'ampiezza della stimolazione elettrica utilizzando un metodo up-down per stimare la soglia elettrica dei nocicettori. Il software è stato costruito sul sistema Open Ephys (V0.54) e codificato in C ++ utilizzando il framework JUCE. Funziona su sistemi operativi Windows, Linux e Mac. Il codice open source è disponibile (https://github.com/
Introduction
I nocicettori sono neuroni afferenti primari nel sistema nervoso periferico che vengono attivati da eventi apertamente o potenzialmente dannosi per i tessuti e svolgono un ruolo protettivo critico nel dolore acuto1. Registrazioni elettrofisiologiche da nocicettori in fibra C e Aδ in modelli animali, volontari umani sani e pazienti hanno rivelato sensibilizzazione e attività spontanea anormale in una vasta gamma di condizioni di dolore 2,3,4,5,6,7. Comprendere i meccanismi che sono alla base di questi cambiamenti nell'eccitabilità dei nocicettori nei pazienti potrebbe consentire interventi terapeutici mirati8. Tuttavia, ci sono pochi strumenti per valutare direttamente l'eccitabilità dei nocicettori, in particolare nei pazienti9, ma il potenziale per l'utilità di tali strumenti è ben riconosciuto10,11.
Il monitoraggio della soglia elettrica del nervo intero può essere utilizzato per esaminare l'eccitabilità assonale negli esseri umani12. Tuttavia, poiché i neuroni periferici di grandi dimensioni e mielinizzati contribuiscono in modo sproporzionato all'ampiezza del potenziale d'azione del composto sensoriale, il monitoraggio della soglia elettrica dell'intero nervo non consente la valutazione della funzione delle fibre C11,13. Infatti, in uno studio precedente, il monitoraggio della soglia elettrica del nervo intero nelle coorti di dolore neuropatico cronico con neuropatia diabetica e polineuropatia indotta da chemioterapia non ha mostrato differenze nell'eccitabilità assonale11.
In uno studio precedente, il tracciamento della soglia elettrica a livello di singolo neurone è stato utilizzato per esaminare l'eccitabilità dei nocicettori delle fibre C durante le registrazioni delle fibre prese in giro in una preparazione di nervo cutaneo di ratto ex vivo 14. Gli autori hanno dimostrato che una maggiore concentrazione di potassio, condizioni acide e bradichinina hanno aumentato l'eccitabilità dei nocicettori delle fibre C, come riflesso da una soglia elettrica ridotta per la generazione del potenziale d'azione. Inoltre, il riscaldamento del campo ricettivo dei nocicettori sensibili al calore ha ridotto la loro soglia elettrica, mentre i nocicettori insensibili al calore hanno mostrato un aumento della loro soglia elettrica14. Ciò fornisce un'importante prova che il tracciamento della soglia elettrica a singolo neurone è possibile e può essere utile, ma attualmente non ci sono soluzioni software e / o hardware disponibili per consentire tali indagini, in particolare per gli studi sull'uomo.
Nell'uomo, la microneurografia è l'unico metodo disponibile per valutare direttamente le proprietà elettrofisiologiche delle fibre C15. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare la disfunzione dei nocicettori in pazienti con dolore cronico 2,3,4,5,6,7. La microneurografia può rilevare potenziali d'azione di un singolo neurone; tuttavia, a causa dei bassi rapporti segnale-rumore, i ricercatori utilizzano la tecnica di marcatura per caratterizzare l'attività delle fibre C16. Nella tecnica di marcatura, la stimolazione elettrica soprasoglia viene applicata ai campi ricettivi della fibra C nella pelle. Questa stimolazione elettrica genera un potenziale d'azione che si verifica a una latenza costante, determinata dalla velocità di conduzione della fibra C. Le fibre C mostrano un rallentamento dipendente dall'attività, per cui la loro velocità di conduzione si riduce e, quindi, la loro latenza di conduzione aumenta durante i periodi di scarica potenziale d'azione17. In condizioni basali, le fibre C normalmente non generano potenziali d'azione in assenza di stimoli nocivi e, pertanto, la loro latenza di conduzione in risposta alla stimolazione elettrica a bassa frequenza è costante. Gli stimoli meccanici, termici o farmacologici, che evocano l'accensione, inducono un rallentamento dipendente dall'attività, che aumenta la latenza dei potenziali d'azione evocati dalla concomitante stimolazione elettrica a bassa frequenza. Ciò consente l'identificazione oggettiva delle risposte agli stimoli non elettrici applicati nel contesto di un basso rapporto segnale-rumore. Pertanto, il rallentamento dipendente dall'attività può essere utilizzato per caratterizzare funzionalmente le fibre C16. In effetti, diverse classi funzionali di fibre C mostrano modelli distintivi di rallentamento dipendente dall'attività nei paradigmi di stimolazione elettrica che comportano la variazione della frequenza di stimolazione18,19. Questa variabilità nella latenza dei potenziali d'azione delle fibre C rappresenta una sfida per gli algoritmi progettati per monitorarli.
L'attività continua in un nocicettore porta ad una maggiore variabilità nella sua latenza durante la stimolazione elettrica a bassa frequenza, e questo è di nuovo dovuto al rallentamento dipendente dall'attività. Questa maggiore variabilità, o jitter, è una misura proxy quantificabile dell'eccitabilità2. Ulteriori cause di variabilità nella latenza del potenziale d'azione includono il flip-flop, in cui vengono stimolati rami terminali alternativi di un singolo neurone, che fa sì che il potenziale d'azione evocato abbia due (o più) latenze basali che si escludono a vicenda20. Infine, i cambiamenti nella temperatura dei rami terminali di un neurone periferico causano anche cambiamenti di latenza del potenziale d'azione in modo termodinamico, con il riscaldamento che aumenta la velocità di conduzione e il raffreddamento rallenta la velocità di conduzione19. Pertanto, qualsiasi software che cerchi di eseguire il tracciamento della soglia elettrica a circuito chiuso delle fibre C nocicettive deve consentire cambiamenti nella latenza nei potenziali d'azione evocati elettricamente.
Per raggiungere il nostro obiettivo di tracciamento della soglia elettrica cross-specie dei nocicettori in fibra C, abbiamo sviluppato APTrack, un plug-in software open source per la piattaforma Open Ephys21, per consentire il monitoraggio della soglia elettrica in tempo reale, a circuito chiuso, e il monitoraggio della latenza. Forniamo dati proof-of-concept che dimostrano che è possibile il tracciamento della soglia elettrica dei nocicettori in fibra C durante la microneurografia umana. Inoltre, dimostriamo che questo strumento può essere utilizzato nell'elettrofisiologia delle fibre stuzzicate ex vivo dei roditori, consentendo così studi traslazionali tra esseri umani e roditori. Qui, descriveremo in dettaglio come i ricercatori possono implementare e utilizzare questo strumento per aiutare il loro studio della funzione e dell'eccitabilità dei nocicettori.
Protocol
Gli esperimenti di microneurografia umana sono stati approvati dal Comitato etico di ricerca della Facoltà di scienze della vita dell'Università di Bristol (numero di riferimento: 51882). Tutti i partecipanti allo studio hanno dato il consenso informato scritto. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti presso l'Università di Bristol in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 dopo l'approvazione da parte dell'Università di Bristol Animal Welfare and ethical review board e sono stati coperti da una licenza di progetto.
1. Installazione della GUI Open Ephys e di APTrack
- Consultare la documentazione del software per trovare la versione più recente dell'interfaccia utente grafica (GUI) Open Ephys supportata (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme), quindi scaricare e installare la GUI.
- Installare una versione compatibile della GUI dal seguente URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
- Scarica l'ultima versione da GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Per un computer Windows, copiare il file .dll nella cartella plugins, che di solito si trova in C:\Program Files\Open Ephys\plugins. Per un computer MacOS, copiare il file .bundle nella cartella Contents/PlugIns del pacchetto.
2. Montaggio dell'apparecchio di registrazione e stimolazione
- Collegare la scheda di acquisizione al computer utilizzando il cavo fornito dal produttore e accenderla.
NOTA: Per la microneurografia umana, è stato utilizzato un isolatore USB 3.0 per isolare elettricamente il partecipante dal computer e la scheda di acquisizione è stata alimentata da una batteria portatile anziché dall'alimentatore a tensione di rete utilizzato per gli studi sui roditori. Tutte le connessioni USB, esclusa la scheda di controllo del motore passo-passo, sono state passate attraverso l'isolatore USB durante gli studi sull'uomo. - Collegare la scheda I/O alla porta di ingresso analogica sulla scheda di acquisizione. Collegare un headstage di registrazione Intan RHD alla scheda di acquisizione utilizzando un cavo SPI (Serial-Peripheral Interface).
NOTA: qui è stato utilizzato l'headstage bipolare a 16 canali Intan, ma possono essere utilizzati altri headstage monopolari della serie RHD2000. - Collegare il PulsePal al computer22. Per il montaggio con uno stimolatore analogico controllato in tensione (ad esempio, un DS4) utilizzando un PulsePal, come con le registrazioni in fibra presa in giro del mouse, seguire i passaggi 2.5.1-2.5.3; per l'assemblaggio con uno stimolatore rotativo basato su encoder (ad esempio, un DS7) utilizzando un motore passo-passo, come per le registrazioni di microneurografia umana, seguire i passaggi 2.6.1-2.6.8 (Figura 1).
- Costruire la catena di segnali nella GUI come descritto di seguito.
- Inserire il plug-in Rhythm FPGA nella catena del segnale facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinandolo nella catena del segnale; questo collega la GUI alla scheda di acquisizione. Assicurarsi che sia stato fatto clic sul pulsante ADC per avviare la registrazione dei canali ADC dalla scheda I/O. Il pulsante ADC si illumina in arancione quando è acceso.
NOTA: Se si desidera riprodurre dati sperimentali registrati in precedenza, il plug-in File Reader può essere utilizzato all'inizio al posto di Rhythm FPGA. L'utilizzo di questo in combinazione con APTrack consentirà la visualizzazione e il monitoraggio della latenza dei potenziali d'azione negli esperimenti precedenti. - Inserire un filtro passa-banda nella catena del segnale; le impostazioni predefinite di 300-6.000 Hz sono adatte sia per le registrazioni umane che per quelle con il mouse. Inoltre, inserire uno splitter dopo di esso.
- Inserire il plugin APTrack nella catena del segnale su un lato dello splitter e LFP Viewer sull'altro lato. LFP Viewer fornisce una tradizionale vista di traccia di tensione simile a un oscilloscopio, utile durante gli esperimenti.
- Inserire un nodo di record dopo il plugin. Nel menu a discesa, modificare il formato di salvataggio dei dati da binario a Apri Ephys. Questo completa una semplice catena di segnali che funziona bene (Figura 2); Tuttavia, è possibile aggiungere componenti aggiuntivi come determinato dai requisiti sperimentali.
NOTA: se il nodo di registrazione viene posizionato prima del plug-in nella catena del segnale, le informazioni di tracciamento del potenziale di azione non verranno salvate. - In alto a destra della GUI, fai clic sul pulsante di riproduzione per iniziare a trasmettere i dati dalla scheda di acquisizione e visualizzarli. Per iniziare la registrazione, fare clic sul pulsante di registrazione circolare accanto al pulsante di riproduzione.
NOTA: è facile dimenticare di fare clic su record; Registriamo i dati dal momento in cui iniziamo ad acquisire per evitare che ciò accada.
- Inserire il plug-in Rhythm FPGA nella catena del segnale facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinandolo nella catena del segnale; questo collega la GUI alla scheda di acquisizione. Assicurarsi che sia stato fatto clic sul pulsante ADC per avviare la registrazione dei canali ADC dalla scheda I/O. Il pulsante ADC si illumina in arancione quando è acceso.
- Per il montaggio con uno stimolatore analogico controllato in tensione, seguire i passaggi descritti di seguito.
- Accendere uno stimolatore a corrente costante che ha la sua ampiezza di stimolazione controllata da un ingresso di tensione analogico. In questo caso è stato utilizzato un DS4 (Figura 1).
- Il canale di uscita 1 PulsePal è per il comando di tensione analogico. Dividere questo segnale utilizzando uno splitter BNC T, quindi collegarlo all'ingresso dello stimolatore a corrente costante e alla scheda I / O in modo che la tensione di comando venga registrata.
- Il canale di uscita 2 di PulsePal è per il marcatore di evento TTL di stimolazione elettrica. Collegalo alla scheda I/O in modo che i marcatori di evento TTL di stimolazione vengano registrati per l'utilizzo da parte del plugin e per l'analisi post hoc.
- Per il montaggio con uno stimolatore analogico controllato in tensione, seguire i passaggi descritti di seguito.
- Accendere uno stimolatore a corrente costante che ha la sua ampiezza di stimolazione controllata da un quadrante rotante codificante. In questo caso è stato utilizzato un DS7 (Figura 1).
- Collegare la scheda di controllo del motore passo-passo al motore passo-passo utilizzando il cavo fornito dal produttore e il supporto magnetico.
- Collegare direttamente la scheda di controllo al computer utilizzando qualsiasi cavo standard da USB A a USB micro-B. Non collegare la scheda di controllo sul lato partecipante dell'isolatore USB poiché anche questa è collegata a un alimentatore di rete a 12 V.
- Se è la prima volta che si utilizza la scheda di controllo, caricare lo script del motore passo-passo da GitHub alla scheda di controllo; Questa operazione deve essere eseguita solo una volta o se vengono rilasciati aggiornamenti software per lo script del motore passo-passo.
- Impostare la manopola di ampiezza di stimolazione sullo stimolatore a corrente costante su 0 mA. Utilizzare una staffa di montaggio personalizzata per interfacciare il motore passo-passo e la ghiera di ampiezza di stimolazione. Questi possono essere stampati in 3D, il che consente soluzioni di montaggio economiche, rapide e personalizzabili. Consulta GitHub per vedere se è già stato progettato un supporto per lo stimolatore scelto.
- Utilizzare un adattatore barilotto personalizzato per collegare il cilindro del motore passo-passo alla ghiera di controllo dell'ampiezza di stimolazione. Questi adattatori dovrebbero essere costruiti in metallo per motivi di resistenza e durata; tuttavia, anche le parti stampate in 3D sarebbero adatte, anche se potrebbe essere necessario sostituirle regolarmente. Consulta GitHub per vedere se è già stato progettato un adattatore barile per lo stimolatore scelto.
- Collegare liberamente la scheda di controllo/l'apparato del motore passo-passo alla manopola di controllo dello stimolatore utilizzando un adattatore di montaggio e barilotto personalizzato.
NOTA: l'adattatore di montaggio e barilotto verrà serrato in seguito una volta avviato il software e il motore passo-passo, automaticamente, impostato sulla posizione zero. - Collegare il PulsePal come descritto nei passaggi del protocollo 2.5.2-2.5.3 (meno collegare il canale di uscita 1 a uno stimolatore), poiché la generazione di marcatori di evento TTL è ancora necessaria per l'analisi e per il funzionamento del plugin. Inoltre, collegare il canale di uscita 2 allo stimolatore DS7 per attivarlo.
- Preparare la preparazione del nervo cutaneo del topo come descritto di seguito.
- Fornire a topi C57BL/6J (Charles River Laboratories, UK, in questo studio) di 2-4 mesi di età e di entrambi i sessi cibo e acqua ad libitum.
- Dopo l'abbattimento mediante sovradosaggio anestetico mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio (≥200 mg/kg) e la conferma della cessazione della circolazione, sezionare la pelle dall'aspetto dorsale della zampa posteriore del topo e del nervo safeno, che innerva quest'area, usando i metodi descritti da Zimmermann et al.23.
- Mantenere la preparazione pelle-nervo nel liquido interstiziale sintetico carbogenato (Tabella 1) a 30-32 °C in metà di un bagno acrilico a doppia camera su misura (velocità di perfusione 15 ml/min, volume 30 ml). Infilare il nervo attraverso un piccolo foro nella camera piena di olio minerale e sigillare con vaselina. L'olio fornisce un ambiente di registrazione isolato.
- Estrarre due filamenti sottili dal tronco del nervo usando una pinza super fine e appenderne uno su ciascun lato di un elettrodo di registrazione bipolare argento / cloruro d'argento.
- Digitalizza e amplifica il segnale neurale utilizzando un headstage bipolare a 16 canali RHD2216 ed elaboralo utilizzando la scheda di acquisizione. Campionare il segnale a 30 kHz, con un filtro passa-banda di 300-6.000 Hz, e visualizzarlo utilizzando la GUI.
- Usando un'asta di vetro smussata, accarezzare la pelle del preparato. Utilizzare l'attività di massa a bassa ampiezza per confermare che la preparazione è viva.
- Eseguire la microneurografia umana con fibra C come descritto di seguito.
- Condurre microneurografia con partecipanti che hanno fornito consenso informato scritto, come descritto in precedenza24.
- Con il partecipante seduto comodamente sdraiato su un letto e sostenuto con cuscini, identificare il nervo peroneo superficiale utilizzando uno scanner ad ultrasuoni e contrassegnare un'area target di circa 5-10 cm prossimale al malleolo laterale, intorno al livello della tibia.
- Sterilizzare la pelle intorno all'area target utilizzando una salvietta al 2% di clorexidina al 70% e inserire un elettrodo di riferimento sterile per via sottocutanea vicino al sito di registrazione previsto a livello della tibia.
- Inserire un elettrodo di registrazione sterile nel nervo peroneo superficiale sotto la guida ecografica all'interno dell'area target.
- Digitalizza e amplifica il segnale neurale utilizzando un headstage bipolare a 16 canali RHD2216 ed elaboralo utilizzando la scheda di acquisizione. Campionare il segnale a 30 kHz, con un filtro passa-banda di 300-6.000 Hz, e visualizzarlo utilizzando la GUI.
NOTA: l'apparecchiatura di acquisizione è stata isolata elettricamente dal laptop da un isolatore USB 3.0 con isolamento RMS da 5 kV e alimentata tramite un alimentatore a batteria da 12 V personalizzato. - Confermare il corretto posizionamento intraneurale accarezzando delicatamente la pelle per rivelare l'attività di massa evocata meccanicamente. Inoltre, i partecipanti di solito riferiscono parestesia nell'aspetto dorsolaterale del piede dopo il posizionamento intraneurale di successo.
3. Configurazione del software e identificazione e fenotipizzazione dei neuroni periferici
- Configurare il software come descritto di seguito.
- Aprire la GUI (Figura 3). Se la scheda di controllo del motore passo-passo è collegata al PC, verrà rilevata e impostata sulla posizione zero. Stringere l'adattatore personalizzato per montaggio e barilotto descritto nei passaggi 2.6.5-2.6.7, poiché la manopola di ampiezza di stimolazione dello stimolatore e il motore passo-passo sono entrambi impostati su zero.
NOTA: se il motore passo-passo e il quadrante di ampiezza di stimolazione non sono entrambi "azzerati", il motore passo-passo può tentare di spostare la manopola di controllo fuori dal suo raggio d'azione, causando danni. - Nel menu delle opzioni, selezionare il canale di trigger. Scegliere il canale ADC contenente il marcatore TTL di stimolazione elettrica dal canale di uscita PulsePal 2.
- Nel menu delle opzioni, selezionare il canale dati e scegliere il canale contenente i dati elettrofisiologici.
- Nel pannello di controllo della stimolazione, definire le ampiezze di stimolazione iniziale, minima e massima utilizzando il cursore. Assicurarsi che la stimolazione corrente sia impostata su 0 in modo che vengano generati i marcatori TTL.
NOTA: Alcuni stimolatori hanno un rapporto di scala input-output che non è 1:1; Considerare questo quando si seleziona un'ampiezza di stimolazione appropriata. Ad esempio, è possibile selezionare un rapporto di uscita 1:10 su alcuni sistemi di stimolazione per ottenere un'uscita più elevata dallo stimolatore a corrente costante. - Nel pannello di controllo della stimolazione, fare clic su F per caricare un file contenente le istruzioni di stimolazione. I protocolli di stimolazione elettrica sono memorizzati come file con valori separati da virgole (CSV) composti dalle frequenze e dalla durata di stimolazione desiderate, consentendo agli utenti di creare paradigmi di stimolazione complessi per i loro esperimenti. Un modello di esempio è disponibile qui: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- Nel pannello di controllo della stimolazione, fare clic su > per iniziare il paradigma di stimolazione caricato. Per impostazione predefinita, APTrack richiede al PulsePal di generare impulsi di onde quadra positive della durata di 0,5 ms di varie ampiezze per controllare l'ampiezza di stimolazione dello stimolatore a corrente costante.
- Il grafico raster temporale inizierà ad aggiornarsi con la risposta alla stimolazione elettrica, con ogni nuova risposta di stimolazione visualizzata come una nuova colonna sulla destra.
- Aprire la GUI (Figura 3). Se la scheda di controllo del motore passo-passo è collegata al PC, verrà rilevata e impostata sulla posizione zero. Stringere l'adattatore personalizzato per montaggio e barilotto descritto nei passaggi 2.6.5-2.6.7, poiché la manopola di ampiezza di stimolazione dello stimolatore e il motore passo-passo sono entrambi impostati su zero.
- Visualizza e identifica i potenziali d'azione dei singoli neuroni.
- Per il successo del rilevamento dei potenziali d'azione del singolo neurone, è importante impostare soglie di immagine adeguate. Nel pannello grafico raster temporale, regolate i valori di soglia dell'immagine bassa, di rilevamento e alta.
- Selezionare una combinazione di colori nel menu delle opzioni. In modalità WHOT (White Hot) (impostazione predefinita), le tensioni al di sotto della soglia bassa dell'immagine sono codificate in nero. Le tensioni tra l'immagine bassa e le soglie di rilevamento sono codificate in scala di grigi. Le tensioni superiori alla soglia di rilevamento sono codificate in verde e le tensioni al di sopra della soglia alta dell'immagine sono codificate in rosso.
- I neuroni periferici mostrano risposte di latenza costante a basse frequenze di stimolazione (<0,25 Hz), e queste risposte sono determinate dalla loro velocità di conduzione e dalla distanza tra i siti di stimolazione e registrazione. Con opportune soglie di immagine impostate, gli eventi di attraversamento della soglia rilevati dagli algoritmi saranno codificati in verde (Figura 4).
- Spostare sistematicamente l'elettrodo stimolante intorno all'area della pelle innervata dal nervo che viene registrato, consentendo un minimo di tre eventi di stimolazione in ciascun sito. Monitorare il grafico raster temporale per gli eventi di attraversamento della soglia (contrassegnati in verde) che si verificano nello stesso punto temporale dopo ogni evento di stimolazione elettrica.
NOTA: Nei topi, è stato utilizzato uno stimolo di ricerca di 5 mA. Nell'uomo, l'ampiezza dello stimolo di ricerca elettrica transcutanea è stata titolata a un punteggio del dolore verbale tale da non superare mai 7/10. - Verificare la presenza di tre eventi di attraversamento della soglia (barre verdi) che appaiono in fila alla stessa latenza e nella stessa posizione di stimolazione; Ciò indica l'identificazione di un potenziale d'azione del neurone periferico.
- Ottimizzare la posizione stimolante dell'elettrodo identificando il punto elettricamente più sensibile del campo ricettivo del neurone bersaglio, quindi fissare l'elettrodo in posizione. A questo punto nella microneurografia umana, passare all'uso di aghi per elettroagopuntura intradermica (diametro 0,2 mm) per la stimolazione elettrica bipolare, nei topi viene utilizzata una sonda stimolante transcutanea personalizzata in modo che la posizione di stimolazione sia costante.
- Per il successo del rilevamento dei potenziali d'azione del singolo neurone, è importante impostare soglie di immagine adeguate. Nel pannello grafico raster temporale, regolate i valori di soglia dell'immagine bassa, di rilevamento e alta.
- Eseguire la classificazione e la fenotipizzazione sensoriale dei neuroni periferici.
- Stimare la soglia elettrica del potenziale d'azione target regolando l'ampiezza della simulazione manualmente o utilizzando APTrack se lo si desidera (descritto nei passaggi 4.1-4.2).
- Stimolare il campo ricettivo a 2 volte la soglia elettrica stimata ad una frequenza di 0,25 Hz durante tutto il protocollo di fenotipizzazione sensoriale.
- Calcola la velocità di conduzione del neurone dividendo la distanza di conduzione per la latenza di conduzione. Le fibre C possono essere identificate da una velocità di conduzione di ≤2 m/s.
- Stimolare meccanicamente il campo ricettivo utilizzando filamenti di von Frey per determinare la soglia meccanica per l'attivazione. La meccanosensazione può essere identificata da potenziali d'azione evocati visibili sulla traccia di tensione e da un aumento della latenza del neurone, se si tratta di una fibra C, con forza sufficiente.
- Riscaldare il campo ricettivo del neurone, osservando nuovamente i potenziali d'azione visibili sulla traccia di tensione e un aumento della latenza del neurone, se si tratta di una fibra C, con sufficiente applicazione di calore. I neuroni insensibili al calore mostreranno una diminuzione della latenza a causa dell'effetto termodinamico sulla propagazione assonale.
NOTA: Nella microneurografia umana, utilizzare un TSC-II per un controllo termico rapido e accurato. Nella preparazione del mouse, aggiungere liquido interstiziale sintetico riscaldato o raffreddato a una camera di isolamento in alluminio posizionata sopra il campo ricettivo per consentire l'accesso ai terminali neuronali limitando la rapida dissipazione del calore nel fluido circostante. Registrare la temperatura utilizzando una termocoppia. - Raffreddare il campo ricettivo, osservando nuovamente i potenziali d'azione visibili sulla traccia di tensione e un marcato aumento della latenza del neurone, se si tratta di una fibra C, con sufficiente applicazione a freddo. Tutti i neuroni mostreranno un aumento della latenza a causa dell'effetto termodinamico sulla propagazione assonale, quindi prestare attenzione nell'etichettare i neuroni come sensibili al freddo sulla base di un aumento della latenza da solo.
4. Monitoraggio della latenza e della soglia elettrica
- Eseguire il monitoraggio della latenza come descritto di seguito.
- Dopo aver identificato i potenziali d'azione di un singolo neurone sul grafico raster temporale, spostare il cursore lineare grigio sul lato destro del grafico raster temporale per regolare la posizione della casella di ricerca.
- Sotto il grafico raster temporale, regolare il dispositivo di scorrimento rotante della larghezza della casella di ricerca su una larghezza appropriata. Restringi la larghezza della casella di ricerca per ridurre la possibilità di picchi di rumore transitori, potenziali d'azione che attivano spontaneamente o altri potenziali d'azione a latenza costante nelle vicinanze identificati erroneamente come potenziali d'azione di interesse.
- Per iniziare a monitorare il potenziale di azione mirato, fai clic sul + sotto la tabella di tracciamento multi-unità. Una nuova riga verrà aggiunta alla tabella contenente i dettagli del potenziale d'azione target, tra cui la posizione della latenza, la percentuale di attivazione su 2-10 stimoli (regolata nel menu delle opzioni) e l'ampiezza del picco rilevata.
- Una volta aggiunto un potenziale d'azione alla tabella di tracciamento multi-unità, l'algoritmo di tracciamento della latenza (Figura 5) verrà eseguito automaticamente su di esso ad ogni successiva stimolazione elettrica.
- Se sono visibili più potenziali d'azione discreti nel grafico raster temporale, aggiungerli alla tabella di tracciamento con più unità come descritto sopra. Il numero massimo teorico di potenziali d'azione che possono essere aggiunti alla tabella per il rilevamento simultaneo della latenza è il valore intero massimo a 32 bit.
- Seleziona la casella Spike traccia nella tabella di rilevamento a più unità per spostare la casella di ricerca nella posizione appropriata per quel particolare potenziale di azione, come determinato dall'algoritmo di rilevamento della latenza. Ciò consentirà di monitorare il monitoraggio della latenza in tempo reale e garantire che il monitoraggio segua il potenziale d'azione come previsto. Il monitoraggio della latenza di altri picchi continuerà normalmente in background.
- Rimuovi i potenziali d'azione rilevati dalla tabella di rilevamento a più unità utilizzando il pulsante Elimina alla fine di ogni riga.
- Eseguire il tracciamento della soglia elettrica come descritto di seguito.
- Regolare i tassi di incremento e decremento nel pannello di controllo della stimolazione tra 0,1 V e 0,5 V. Mantenere questi valori uguali e non regolarli durante l'esperimento a meno che ciò non faccia parte del paradigma sperimentale.
- Assicurarsi che la frequenza di stimolazione sia impostata su una frequenza appropriata, tipicamente 0,25-0,5 Hz, a meno che la modulazione della frequenza di stimolazione non faccia parte del paradigma sperimentale. L'aumento della velocità di attivazione dei nocicettori può alterare la soglia elettrica del nocicettore.
- Una volta che un potenziale d'azione viene monitorato correttamente, selezionare la casella Soglia traccia nella tabella di tracciamento multi-unità, che avvierà l'algoritmo di tracciamento della soglia elettrica (Figura 6).
NOTA: il tracciamento della soglia elettrica viene eseguito solo sul potenziale d'azione mirato; Infatti, le velocità di attivazione di altri potenziali d'azione nella tabella di tracciamento multi-unità verranno aggiornate di conseguenza al variare dell'ampiezza della stimolazione. - Regolare manualmente l'ampiezza della stimolazione in base alla stima della soglia elettrica; Ciò ridurrà il tempo di attesa per determinare la soglia elettrica. Il tempo necessario per stabilire una soglia elettrica affidabile dipende dalla frequenza di stimolazione, dai tassi di incremento e decremento e dalla differenza nell'ampiezza della stimolazione dalla stimolazione iniziale alla soglia elettrica del neurone.
- Il software utilizza un metodo up-down per la stima della soglia elettrica dei neuroni. Nella tabella di tracciamento multi-unità, la velocità di accensione viene determinata su 2-10 stimolazioni precedenti (selezionate nel menu delle opzioni). Selezionare il numero di eventi di stimolazione da considerare; Un numero più elevato aumenterà l'affidabilità della stima della soglia, ma richiederà più tempo per raggiungerla.
- Durante la microneurografia umana, è importante monitorare la dolorabilità degli stimoli elettrici per prevenire un eccessivo disagio dei partecipanti; alcuni disagi sono inevitabili durante lo studio dei nocicettori, in particolare delle fibre C silenziose/addormentate. Chiedere regolarmente le valutazioni del dolore mentre l'ampiezza della stimolazione aumenta durante il tracciamento della soglia elettrica e rimanere vicino allo stimolatore a corrente costante per disinnestarlo su richiesta del partecipante.
NOTA: In alternativa, la stimolazione elettrica può essere disinserita attraverso l'interfaccia utente facendo clic sul pulsante [ ] nel pannello di controllo della stimolazione. - Una velocità di sparo del 50% indica che la soglia elettrica approssimativa è stata determinata.
- Durante il monitoraggio della soglia elettrica, applicare una manipolazione sperimentale al campo ricettivo, come la temperatura o le manipolazioni farmacologiche. Gli effetti di queste manipolazioni sulla soglia elettrica del nocicettore saranno monitorati.
NOTA: Concedere tempo sufficiente per identificare una nuova soglia di nocicettori dopo la manipolazione sperimentale.
Representative Results
Un esempio rappresentativo del software che lavora per controllare un esperimento è mostrato nella Figura 7. Regola iterativamente l'ampiezza della stimolazione utilizzando un metodo up-down per trovare efficacemente la soglia elettrica dei singoli nocicettori. Per la prima volta, dimostriamo la fattibilità del monitoraggio della soglia elettrica a singolo neurone in tempo reale negli esseri umani durante la microneurografia (Figura 7A). Inoltre, mostriamo il tracciamento della soglia elettrica in una fibra Aδ del topo (Figura 7B). L'identificazione dei potenziali d'azione mediante attraversamento della soglia, come qui utilizzata, è sufficiente per tracciare le soglie elettriche nel tempo. Consigliamo agli utenti di adottare misure per ridurre al minimo il rumore elettrico durante le registrazioni, ad esempio utilizzando una gabbia di Faraday e filtri passa-banda per migliorare il rapporto segnale-rumore.
Per dimostrare che il tracciamento della soglia elettrica può essere utilizzato come misura dei cambiamenti nell'eccitabilità dei nocicettori negli esseri umani, è stato eseguito il monitoraggio della soglia elettrica durante un paradigma di riscaldamento a gradini (Figura 8). L'aumento della temperatura dei terminali nocicettori ha diminuito la corrente di stimolazione elettrica richiesta per suscitare un potenziale d'azione, riflettendo un aumento dell'eccitabilità dei nocicettori (Figura 8C). Ciò è stato probabilmente causato dalla generazione di potenziali recettoriali da parte dei canali ionici sensibili al calore espressi nel nocicettore14 della fibra C. Al massimo livello di temperatura, 44 °C, sono stati suscitati potenziali d'azione evocati termicamente (Figura 8A, numero di stimolo 86-96). Ciò provoca un aumento della soglia elettrica in quanto il nocicettore può essere in uno stato refrattario dopo una scarica ad alta frequenza. Come previsto, la latenza del potenziale d'azione tracciato è diminuita all'aumentare della temperatura. Si pensa che ciò si verifichi a causa di un effetto termodinamico sul macchinario di conduzione, che aumenta la velocità di conduzione della fibra C. Questa fibra C può anche esibire flip-flop (Figura 8B, numero di stimolo 47-54), che può comportare un aumento errato della seguente stimolazione elettrica in ampiezza se il potenziale d'azione non rientra nella finestra di ricerca dell'algoritmo.
Figura 1: Uno schema della configurazione dell'apparecchiatura e dei collegamenti dei cavi necessari per il tracciamento della soglia elettrica dei nocicettori con APTrack nei roditori e nell'uomo. Nota i due diversi metodi di controllo dell'ampiezza della stimolazione: un motore passo-passo per stimolatori regolati manualmente nella nostra configurazione umana e un PulsePal per stimolatori controllati dalla tensione di ingresso nella nostra configurazione di roditori. (1) Un PC (Windows, Mac o Linux) che esegue il plugin per la piattaforma Open Ephys. (2) Un motore passo-passo che aziona la manopola di ampiezza di stimolazione sul DS7. (3) Uno stimolatore a corrente costante approvato per l'uso nell'uomo; qui abbiamo usato una DS7. (4) Un optoisolatore USB 3.0, che isola il partecipante umano dal PC (opzionale, richiesto solo per la ricerca umana). (5) Un generatore di impulsi PulsePal V2, che genera timestamp TTL (canale di uscita 2) e passi di tensione corrispondenti all'ampiezza di stimolazione richiesta (canale di uscita 1). (6) uno stimolatore a corrente costante per l'uso negli animali; qui, abbiamo usato una DS4. (7) Un alimentatore CC per il sistema (alimentatore CC di rete utilizzato per la configurazione del roditore e alimentatore CC della batteria utilizzato per la configurazione umana). (8) Un comitato di acquisizione. (9) Una scheda I/O per collegare i cavi coassiali BNC che trasportano i segnali da registrare, come le uscite della termocoppia e i marcatori TTL. (10) La preparazione pelle-nervo del topo sottoposta a registrazioni elettrofisiologiche dei nocicettori. (11) Un partecipante umano sottoposto a registrazione microneurografica da fibre C nel nervo peroneo superficiale. (12) Un headstage Intan RHD2216 per l'acquisizione e la digitalizzazione delle registrazioni. (13) Una scheda adattatore per elettrodi Intan, a cui sono collegati gli elettrodi di registrazione e che consente di trasmettere il segnale all'headstage RHD2216. (14) Un sistema di stimolazione termica in grado di emettere la temperatura tramite una connessione coassiale BNC. (15) Un pulsante/pedale alimentato a batteria da 3,3 V utilizzato per contrassegnare gli eventi di stimolazione meccanica e le applicazioni farmacologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Catena di segnali del modello. La freccia rossa punta al pulsante per abilitare l'ingresso ADC dalla scheda I/O. La freccia gialla indica il menu a discesa per selezionare il formato di file Open Ephys. La freccia verde indica i pulsanti Riproduci e Registra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Interfaccia utente grafica. La GUI è composta da quattro componenti principali. (1) Pannello Grafico raster temporale (verde) per la visualizzazione dei dati e le impostazioni associate al controllo del grafico. Una risposta di latenza costante che mostra un rallentamento graduale dipendente dall'attività è indicata dalla freccia verde. (2) Pannello di controllo della stimolazione (giallo) per impostare i parametri di ampiezza della stimolazione e caricare gli script del paradigma di stimolazione. (3) Tabella di tracciamento multi-unità (blu) per aggiungere i potenziali d'azione per il tracciamento e l'attivazione della latenza e del tracciamento della soglia elettrica. (4) Menu Opzioni per selezionare gli stili di colore e il canale di input per i trigger dati e TTL. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Facilitazione dell'identificazione di potenziali d'azione a latenza costante attraverso la visualizzazione dei dati in tempo reale su un grafico raster temporale utilizzando APTrack. Questo è un esempio di elevato rapporto segnale-rumore. I dati presentati nel grafico raster temporale provengono da una registrazione umana in fibra C dal nervo peroneo superficiale durante la microneurografia. Voltage Trace è il plugin LFP Viewer simile all'oscilloscopio all'interno di Open Ephys. L'interfaccia utente APTrack è l'interfaccia utente grafica del plugin. Il potenziale d'azione tracciato è indicato da frecce verdi e il cursore circolare sul bordo del grafico raster temporale serve per controllare la posizione della casella di ricerca in cui gli algoritmi cercheranno gli eventi di attraversamento della soglia. L'artefatto di stimolazione elettrica è contrassegnato in blu sulla traccia di tensione. L'ampiezza di stimolazione del comando di tensione analogico è indicata in rosso; Si noti che questo potrebbe non essere lo stesso dell'ampiezza della corrente di stimolazione a seconda del fattore di scala impostato sullo stimolatore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Rappresentazione grafica dell'algoritmo di tracciamento della latenza. In termini semplici, se un potenziale d'azione viene rilevato dal passaggio di soglia, la casella di ricerca regolerà la sua posizione per centrarsi al momento della tensione di picco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Rappresentazione grafica dell'algoritmo di tracciamento della soglia elettrica. In termini semplici, se un potenziale d'azione viene rilevato dal superamento della soglia, l'ampiezza della stimolazione sarà diminuita del tasso di decremento. Se non viene rilevato alcun potenziale d'azione, l'ampiezza della stimolazione verrà aumentata della velocità di incremento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Tracciamento automatico della soglia elettrica dei potenziali d'azione di un singolo neurone a una frequenza di stimolazione di 0,25 Hz . (A) Tracce sequenziali di una fibra C umana del nervo peroneo superficiale durante un esperimento di microneurografia. (B) Tracce sequenziali di una fibra Aδ di topo del nervo safeno durante la preparazione del nervo cutaneo hanno preso in giro l'elettrofisiologia delle fibre. Le tracce sono state colorate di rosso quando è stato identificato un potenziale d'azione, con conseguente diminuzione dell'ampiezza dello stimolo. L'algoritmo software trova efficacemente l'ampiezza dello stimolo richiesta per una probabilità del 50% di sparare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Tracciamento della soglia elettrica ad una frequenza di stimolazione di 0,25 Hz durante la stimolazione termica di un nocicettore umano in fibra C. L'asse y codifica il numero di stimolazione dall'inizio del paradigma. (A) Traccia di tensione per 4.000 ms dopo stimolazione elettrica, con eventi di superamento della soglia contrassegnati in rosso. (B) Traccia di tensione da A ingrandita attorno al potenziale d'azione tracciato. Le tracce sono state colorate di rosso quando è stato rilevato il potenziale d'azione tracciato. La linea blu verticale è la latenza di base dell'unità tracciata. (C) Corrente di stimolazione comandata da APTrack. La linea blu verticale è la soglia elettrica di base. (D) Temperatura della sonda termostimolante TCS-II campo ricettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composto | Concentrazione |
| NaCl | 107,8 mM |
| NaHCO3 | 26,2 mM |
| Kcl | 3,5 mM |
| NaH2PO4 | 1,67 mM |
| CaCl2 | 1,53 mM |
| MgSO4 | 0,69 mM |
| Gluconato di sodio | 9,64 mM |
| Saccarosio | 7,6 mM |
| Glucosio | 5,55 mM |
Tabella 1: Contenuto del liquido interstiziale sintetico per la preparazione del nervo cutaneo del topo23.
Discussion
APTrack è un plugin software da utilizzare con la piattaforma Open Ephys. Abbiamo scelto questa piattaforma in quanto è open-source, flessibile ed economica da implementare. Escludendo il costo dello stimolatore a corrente costante, tutte le attrezzature necessarie per iniziare a utilizzare il plugin potrebbero essere acquistate per circa $ 5.000 USD al momento della scrittura. Speriamo che ciò consentirà ai ricercatori di implementare APTrack nei loro studi di elettrofisiologia dei nervi periferici più facilmente. Inoltre, i ricercatori possono modificare liberamente il software per soddisfare le loro esigenze sperimentali. È importante sottolineare che questo strumento ha permesso il tracciamento della soglia elettrica di singoli nocicettori in fibra C, per la prima volta, negli esseri umani.
Maggiore è il rapporto segnale-rumore, meglio gli algoritmi possono identificare i potenziali d'azione. Il rapporto segnale-rumore durante la microneurografia era sufficiente nella maggior parte delle nostre registrazioni, ma gli utenti devono essere attenti al rischio di degradazione del segnale nel tempo. Ciò è particolarmente importante per protocolli sperimentali più lunghi, perché se l'ampiezza del potenziale d'azione tracciato scende al di sotto della soglia di rilevamento, l'ampiezza della stimolazione verrà aumentata erroneamente; Questo può essere mitigato dagli sperimentatori che monitorano il plugin e quindi regolano le impostazioni, se necessario. Il rapporto segnale/rumore è migliorato con il filtraggio passa banda, ma i transienti più grandi possono ancora essere identificati erroneamente come potenziali d'azione se dovessero arrivare durante la finestra temporale della casella di ricerca. Il rischio di identificare erroneamente il rumore transitorio come potenziale d'azione può essere ridotto restringendo la finestra temporale durante la quale il plugin cerca i potenziali d'azione e ottimizzando le impostazioni di soglia. Tuttavia, ci sono ancora situazioni che si possono incontrare che impediscono le prestazioni del plugin. L'attività spontanea può causare difficoltà se i potenziali d'azione di ampiezza maggiore rientrano nella finestra della casella di ricerca dell'algoritmo, poiché verranno erroneamente identificati come potenziali d'azione target. Inoltre, l'attività spontanea nel neurone di interesse può significare che la stimolazione elettrica cade durante il suo periodo refrattario, causando l'incapacità di generare un potenziale d'azione. Le difficoltà nell'uso del software possono anche sorgere quando i neuroni afferenti primari mostrano flip-flop, per cui vengono stimolati rami terminali alternativi di un singolo neurone, facendo così sì che il potenziale d'azione evocato abbia due (o più) latenze basali che si escludono a vicenda20. Durante le registrazioni da neuroni che mostrano flip-flop con alti rapporti segnale-rumore, abbiamo eseguito con successo il tracciamento della latenza e della soglia elettrica aumentando la larghezza della casella di ricerca per incapsulare tutte le potenziali velocità di conduzione esibite dal neurone. Tuttavia, la soglia elettrica può variare a seconda del ramo terminale del neurone che viene eccitato, il che è probabilmente in parte dovuto alle differenze nella distanza dal sito della stimolazione elettrica ai terminali nocicettori alternativi. È possibile un ulteriore lavoro sul processo di identificazione del potenziale d'azione per includere, ad esempio, la corrispondenza dei modelli e potrebbe essere integrato in questo software. I plugin GUI per il band-stop o la filtrazione adattiva del rumore potrebbero anche essere utilizzati a monte di APTrack nella catena del segnale se dovessero essere sviluppati.
Consideriamo la soglia elettrica determinata come la corrente richiesta per suscitare un potenziale d'azione il 50% del tempo, su un numero definito dall'utente di stimoli elettrici, tipicamente 2-10. La morfologia della stimolazione elettrica è di 0,5 ms e impulsi positivi a onda quadra. Questo non è lo stesso che determinare la reobase, una misura comunemente usata di eccitabilità neuronale. Il plugin potrebbe essere adattato per determinare la reobase. Tuttavia, abbiamo perseguito una misura più semplice, poiché i cambiamenti dinamici nell'eccitabilità, come quelli ipotizzati durante il riscaldamento, sarebbero stati più difficili da quantificare con i cambiamenti della reobase rispetto alla nostra stima della soglia elettrica.
Questo software può essere utilizzato in esperimenti sia umani che di roditori. Ciò è reso possibile dal supporto flessibile per i sistemi di stimolazione elettrica. Il software funzionerà con qualsiasi stimolatore che accetta una tensione di comando analogica o può essere interfacciato manualmente con un motore passo-passo. Per la microneurografia, lo abbiamo usato con uno stimolatore a corrente costante marcato CE che è stato progettato per l'uso nella ricerca umana e aveva la sua stimolazione controllata da un quadrante. Gli stimolatori che accettano comandi di tensione analogici possono essere rumorosi in quanto non scollegano il circuito tra gli stimoli, il che significa che qualsiasi ronzio o rumore a 50/60 Hz sull'ingresso analogico verrà trasmesso alla registrazione. Uno stimolatore che richiede un segnale di trigger TLL aggiuntivo per collegare il circuito, consentendo di generare uno stimolo a una corrente analoga all'ingresso di tensione analogico, è ideale per l'uso con il plugin. Ciò impedisce che il rumore venga trasmesso alla registrazione tra gli stimoli.
Il software utilizza un semplice metodo up-down per stimare la soglia elettrica. Questo è stato usato nei test di psicofisica per molti decenni25. In linea con il metodo up-down, l'algoritmo di tracciamento della soglia elettrica per modulare l'ampiezza della stimolazione considera solo l'ampiezza e la risposta della stimolazione precedente quando si calcola l'ampiezza della stimolazione successiva. Ciò significa che l'ampiezza della stimolazione oscillerà attorno alla vera soglia elettrica, producendo così una velocità di accensione del 50%, supponendo che la soglia sia stabile. La dimensione minima di un incremento o decremento è 0,01 V; ciò equivale a 0,01 mA supponendo che lo stimolatore abbia un rapporto ingresso-uscita di 1 V:1 mA e una risoluzione sufficiente per ottenere cambiamenti di passo così piccoli. Il plugin aggiornerà la stima in tempo reale della soglia elettrica del potenziale d'azione target ogni volta che raggiunge una velocità di attivazione del 50% su un numero definito dall'utente di stimoli precedenti (2-10). Post hoc, raccomandiamo di utilizzare una media mobile dell'ampiezza della stimolazione negli ultimi 2-10 stimoli per stimare la soglia elettrica, e va notato che questa stima sarà accurata solo quando la velocità di accensione è relativamente stabile al 50%. Sia nelle stime live che post hoc della soglia elettrica, c'è un equilibrio tra risoluzione, affidabilità e tempo da considerare. L'utilizzo di piccoli passi di incremento e decremento aumenterà l'accuratezza della stima della soglia elettrica, ma aumenterà il tempo necessario per trovare la nuova soglia elettrica inizialmente e dopo la perturbazione. Il calcolo della soglia elettrica su un numero maggiore di stimoli precedenti fornirà una migliore affidabilità ma aumenterà il tempo necessario per raggiungere una stima accurata.
APTrack è stato progettato per l'uso nelle registrazioni dei nervi periferici, in particolare per tracciare le soglie elettriche delle fibre C durante perturbazioni sperimentali e patologiche in periodi in cui la latenza potenziale d'azione può variare a seconda dell'attività neuronale sottostante. Questo metodo consentirà l'esame non solo dell'eccitabilità assonale, ma anche dei potenziali generatori di nocicettori in volontari e pazienti sani. Prevediamo che altri campi dell'elettrofisiologia possano adottare e adattare questo strumento per l'uso in qualsiasi esperimento che richieda il monitoraggio della soglia elettrica di un'attività bloccata dallo stimolo. Ad esempio, questo potrebbe essere facilmente adattato per la stimolazione optogenetica con impulsi luminosi guidati da APTrack. Il plugin è open-source e disponibile per i ricercatori sotto licenza GPLv3. È costruito sulla piattaforma Open Ephys, che è un sistema di acquisizione dati adattabile, a basso costo e open source. Il plugin fornisce hook aggiuntivi per i plugin a valle per estrarre le informazioni sul potenziale d'azione e fornire interfacce utente aggiuntive o paradigmi adattivi. Il plugin fornisce una semplice interfaccia utente per la visualizzazione e il monitoraggio della latenza dei potenziali d'azione in tempo reale. Può anche riprodurre i dati precedenti e visualizzarli utilizzando il grafico raster temporale. Inoltre, può anche eseguire il monitoraggio della latenza durante la riproduzione di dati precedenti. Mentre ci sono altri pacchetti software disponibili per il monitoraggio della latenza in tempo reale, non sono open-source e non possono eseguire il tracciamento della soglia elettrica26,27. APTrack ha un vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di identificazione dei potenziali d'azione a latenza costante dalle tracce di tensione in quanto utilizza un grafico raster temporale per la visualizzazione dei dati. Inoltre, le nostre esperienze di utilizzo in esperimenti con bassi rapporti segnale-rumore hanno indicato che il metodo di visualizzazione del grafico raster temporale consente l'identificazione di potenziali d'azione a latenza costante che altrimenti sarebbero stati persi.
Il monitoraggio della soglia del nervo intero è un metodo ampiamente utilizzato per valutare l'eccitabilità assonale13. Il tracciamento della soglia elettrica del singolo neurone nelle fibre C dei roditori è stato utilizzato in precedenza per quantificare l'eccitabilità dei nocicettori14 e la sua utilità nell'uomo è riconosciuta10,11; Tuttavia, fino ad ora, questo non era possibile. Forniamo un nuovo strumento open source per misurare direttamente l'eccitabilità dei singoli nocicettori negli studi elettrofisiologici sui roditori e sui nervi periferici umani. APTrack consente per la prima volta il monitoraggio in tempo reale, open-source, della soglia elettrica dei potenziali d'azione dei singoli neuroni negli esseri umani. Prevediamo che faciliterà gli studi traslazionali dei nocicettori tra roditori e umani.
Disclosures
G.W.T.N. è una borsa di dottorato BBSRC Collaborative Training Partnership con l'Università di Bristol e Eli Lilly and Company (BB / T508342 / 1). A.P.N. è attualmente un dipendente di Eli Lilly and Company e può possedere azioni di questa società.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i nostri finanziatori per il loro sostegno: Academy of Medical Sciences (J.P.D., A.E.P.), Versus Arthritis (J.P.D., A.E.P.), Jean Golding Institute Seedcorn Grant (J.P.D., A.E.P., G.W., A.C.S., M.M.P.) e Biotechnology and Biological Sciences Research Council partnership partnership doctorship con Eli Lilly (G.W.T.N.). Vorremmo estendere i nostri ringraziamenti a tutti coloro che hanno contribuito allo sviluppo di APTrack. Vorremmo anche ringraziare i nostri volontari che hanno partecipato agli esperimenti di microneurografia e i nostri collaboratori di coinvolgimento e coinvolgimento dei pazienti e del pubblico per il loro inestimabile contributo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
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