Här presenterar vi ljusinducerad dielektrofores som en etikettfri metod för att karakterisera heterogena cellinjer, specifikt humana mesenkymala stamceller (hMSC). Detta dokument beskriver ett protokoll för att använda och optimera en mikrofluidisk enhet med ett fotoledande skikt för att karakterisera det elektriska beteendet hos hMSC utan att ändra deras ursprungliga tillstånd.
Humana mesenkymala stamceller (hMSC) erbjuder en patient-härledd cellkälla för att genomföra mekanistiska studier av sjukdomar eller för flera terapeutiska tillämpningar. Att förstå hMSC-egenskaper, såsom deras elektriska beteende vid olika mognadsstadier, har blivit viktigare de senaste åren. Dielektrofores (DEP) är en metod som kan manipulera celler i ett ojämnt elektriskt fält, genom vilket information kan erhållas om cellernas elektriska egenskaper, såsom cellmembrankapacitans och permittivitet. Traditionella metoder för DEP använder metallelektroder, såsom tredimensionella elektroder, för att karakterisera cellernas respons på DEP. I denna artikel presenterar vi en mikrofluidisk enhet byggd med ett fotoledande skikt som kan manipulera celler genom ljusprojektioner som fungerar som in situ virtuella elektroder med lätt formbara geometrier. Ett protokoll presenteras här som demonstrerar detta fenomen, kallat ljusinducerad DEP (LiDEP), för att karakterisera hMSC. Vi visar att LiDEP-inducerade cellsvar, mätt som cellhastigheter, kan optimeras genom olika parametrar såsom ingångsspänning, ljusprojektionernas våglängdsområden och ljuskällans intensitet. I framtiden ser vi framför oss att denna plattform kan bana väg för teknologier som är etikettfria och utför realtidskarakterisering av heterogena populationer av hMSC eller andra stamcellslinjer.
Mänskliga mesenkymala stamceller (hMSC) är kända för sina immunsuppressiva egenskaper1, vilket har lett till deras användning i terapeutiska medel för behandling av en mängd olika sjukdomar, såsom typ II-diabetes2, transplantat mot värdsjukdom3 och leversjukdom4. HMSC är heterogena och innehåller subpopulationer av celler som differentieras till adipocyter, kondrocyter och osteoblaster. HMSC härrör från fettvävnad, navelsträngsvävnad och benmärg, och deras differentieringspotential beror på ursprungsvävnaden och cellodlingsprocessen som används5. Till exempel, enligt en studie av Sakaguchi et al., är hMSC härrörande från fettvävnad mer benägna att differentiera till adipocyter, medan hMSC härrörande från benmärg är mer benägna att differentiera till osteocyter6. Effekten av vävnadens ursprung hos hMSC på deras differentieringspotential är dock ett fenomen som fortfarande behöver förstås ytterligare. Dessutom bidrar de olika differentieringspotentialerna hos hMSC till deras inneboende heterogenitet och skapar utmaningar vid tillämpning av hMSC för terapi. Som sådan är karakterisering, såväl som sortering, av heterogena stamcellslinjer avgörande för att utveckla in vitro och klinisk tillämpning av dessa celler. Flödescytometri, guldstandardtekniken för att undersöka skillnader i cellulära fenotyper, använder cellytantigener och fluorescerande färgämnen för att märka målceller och karakterisera dem baserat på ljusspridning eller cellspecifika fluorescensegenskaper 6,7,8. Nackdelarna med denna metod inkluderar den begränsade tillgängligheten av cellytantigenbiomarkörer, den höga kostnaden för utrustning och drift och det faktum att cellytfärgningen potentiellt kan skada cellmembranet och påverka terapeutiska tillämpningar 9,10,11. Att utforska nya tekniker för cellkarakterisering utan att äventyra cellmembranets ursprungliga tillstånd kan därför gynna den kliniska prestandan hos stamcellsterapier.
Dielektrofores (DEP), en metod för cellkarakterisering som inte använder ytetiketter, är fokus för detta nuvarande arbete. DEP är en etikettfri eller icke-färgningsmetod implementerad på mikrofluidiska plattformar för att karakterisera heterogena populationer av celler baserat på deras elektriska egenskaper. DEP använder ett elektriskt växelströmsfält som ersättning för fluorescensfärgning (dvs. en etikettbaserad metod)7. De andra fördelarna med att använda DEP-baserade mikrofluidiska anordningar för cellkarakterisering inkluderar användning av små volymer (mikroliter), snabb analystid, minimala krav på cellprovberedning, minimal risk för provkontaminering, minimal avfallsproduktion och låg kostnad12,13. En annan fördel med DEP är realtidsövervakning av celler14,15,16. För DEP utsätts celler i suspension för ett ojämnt växelströmsfält skapat med elektroder, och de blir polariserade6. Denna polarisering orsakar cellrörelse och möjliggör cellmanipulation baserat på frekvensen och spänningen hos det applicerade växelströmsfältet. Genom att justera frekvensen, vanligtvis mellan 5 kHz och 20 MHz, kan celler lockas till eller stötas bort från elektroderna, vilket motsvarar positivt respektive negativt DEP-beteende6.
Det finns flera lägen för DEP-karakterisering, nämligen traditionell, fältflödesfraktionering och ljusinducerad, som klassificeras av deras elektrodkonfiguration och / eller driftsstrategi17. 3DEP-analysatorn, ett traditionellt läge för DEP, innehåller fysiska metallelektroder och övervakar det cellulära svaret på ett elektriskt växelströmsfält. Detta system använder ett chip bestående av mikrobrunnar med flera tredimensionella cirkulära elektroder och detekterar förändringar i ljusintensiteter för att karakterisera cell DEP-beteende 18,19,20,21. Positiv dataexekveringsskydd observeras när cellerna rör sig mot kanterna på de cirkulära elektroderna längs mikrobrunnens väggar, vilket resulterar i ökad ljusintensitet i mitten av mikrobrunnen. Negativ DEP observeras när celler kluster i mitten av mikrobrunnen bort från de cirkulära elektroderna, vilket resulterar i minskad ljusintensitet i mitten av mikrobrunnen. Dessa två fenomen representeras i figur 1. Traditionella DEP-metoder har förmågan att karakterisera de elektriska egenskaperna hos heterogena cellpopulationer 18,20,21. Till exempel visade Mulhall et al. potentialen att skilja mellan normala orala keratinocyter (HOK) och maligna orala keratinocyter (H357) cellinjer baserat på skillnader i membrankapacitans21 med hjälp av 3DEP-analysatorn. En begränsning av traditionella sätt att exekvera genom dataexekveringsskydd är emellertid den fasta elektrodgeometrin. Eftersom hMSC är heterogena är det fördelaktigt att ha förmågan att enkelt modifiera elektrodgeometrierna under DEP-bedömningar. Att till exempel kunna modifiera elektroderna eller elektrodmatriserna i realtid för encellsfångst gör att cellerna kan karakteriseras baserat på hastighet och DEP-beteende. Tillämpningen av elektrodmodifiering i realtid i DEP-bedömningar av hMSC möjliggör encellsanalys av hMSC direkt efter att de hämtats från provvävnaden för att karakterisera heterogeniteten hos provpopulationen.
För att övervinna begränsningen av traditionella sätt för DEP (dvs. fasta fysiska elektroder) och utforska nya möjligheter för elektrodkonfigurationsändringar i realtid med hjälp av DEP-fenomenet har ljusinducerad DEP (LiDEP) undersökts. LiDEP är ett icke-traditionellt sätt för DEP som manipulerar celler med hjälp av en fotoledande mikrofluidisk enhet22,23 via ljusprojektioner, lokaliserade elektroder skapar ett ojämnt elektriskt fält, liknande den traditionella DEP-metoden. Detta tillvägagångssätt möjliggör också flexibilitet i elektrodgeometrin och för att flytta elektroderna inom den mikrofluidiska anordningen. Detta mildrar begränsningen som ses med fasta elektroder och ger möjlighet att få mer information om cellulär heterogenitet. LiDEP har använts för att detektera och analysera olika celltyper i homogena och heterogena populationer av celler22,23,24. Till exempel använde Liao et al. LiDEP för att separera cirkulerande tumörceller (CTC) som uttrycker epitelcelladhesionsmodulen (EpCAMneg) från röda blodkroppar för att utforska deras betydelse vid cancermetastaser22. Encellsanalys med LiDEP har framgångsrikt använts för att karakterisera och manipulera cancerceller med stratifiering av tumörigenicitet23 i bukspottskörteln och analys av CTC i prover före och efter metastasering24.
Här beskriver vi hur LiDEP kan användas för att manipulera hMSC med en mängd olika elektrodgeometrier (cirkel-, diamant-, stjärn- och parallella linjer) och systeminställningar (applicerad spänning, ljusintensitet och mikrofluidiskt enhetsmaterial), vilket ger ett tillvägagångssätt för att karakterisera beteendet hos mänskliga stamceller med virtuella elektroder.
Att undersöka heterogeniteten hos hMSC är viktigt för deras framsteg inom terapi. Detta arbete utgör ett första steg för att använda LiDEP som ett analytiskt verktyg för bedömning av hMSC. Vi undersökte spänningsberoendet av det positiva DEP-svaret hos celler i LiDEP genom att kvantifiera hastigheten. Det förväntas att högre spänningar bör ge starkare positiv DEP-kraft, och vi observerade detta mönster med de uppmätta hastigheterna. Spänningarna 10 V pp och 20 Vpp var tillräckliga för manipulering av hMSC med LiDEP. Lägre spänningar (dvs. 5 Vpp) resulterade i långsammare cellsvar; även om det inte är optimalt för hMSC, kan detta vara fördelaktigt för andra celltyper. Det fanns en spänningsberoende minskning av hMSC: s livskraft på cirka 9%. Detta skiljer sig något från den tidigare litteraturen 6,12,28,29, där användningen av traditionell DEP och LiDEP vid undersökning av biologiska celler inte minskade cellviabiliteten. Det experimentella målet i varje studie varierade dock. Glasser och Fuhr övervakade tillväxten av vidhäftande L929-musfibroblaster på metallelektroder i cellodlingsmedium28. Omvänt undersökte Lu et al. livskraften hos neurala stamceller som exponerades för växelströmselektriska fält under olika tidsperioder12. karakteriserade de dielektriska egenskaperna hos hMSC med metallelektroder12 och Li et al. manipulerade leukemiceller med LiDEP29. Skillnaden mellan dessa studier och vår var användningen av BSA, vilket kan vara orsaken till den minskade lönsamheten vi observerade. Den lägre totala livskraften kan dock också bero på exponeringstiden (2 min 30 s) som används i protokollet som fastställs här. Denna tid valdes för att ge tillräckligt med tid för att visualisera cellmanipulation under exponering för det ojämna växelströmsfältet.
Metoderna för cellkarakterisering testades via elektrodfärgen för att bestämma kapaciteten och begränsningarna hos vårt LiDEP-system byggt enligt beskrivningen i protokollet. I detta specifika protokoll kan elektrodfärgen styras baserat på färgen på formen som projiceras genom en grafisk redigeringsfil. Vi använde fyra färger: vit, gul, röd och blå. Från effektavläsningarna för varje färg mättes de projicerade gula (#FFFF00) och vita (#FFFFFF) elektroderna för att ha högre intensiteter, vilket var grunden för varför dessa färger var mer gynnsamma att använda i de efterföljande experimenten. Dessutom, på grund av det etablerade ljusintensitetsberoendet av fotoledande material30,31, tyder resultaten på att LiDEP-enheternas prestanda bygger på fotoledande A: Si och kan ställas in genom valet av den projicerade elektrodfärgen. En kombination av positiva och negativa DEP-svar från hMSC observerades också med användning av LiDEP, vilket är som fenomenet som ses i traditionella DEP-metoder. Med varje elektrodfärg upplevde hMSC: erna negativ DEP-kraft, positiv DEP-kraft och cellrotation, vilket indikerar att cellprovet var heterogent vid en enda frekvens (kompletterande video 1). Detta överensstämmer med resultaten från Adams et al.6 att hMSC uppvisar både negativt och positivt DEP-beteende vid en enda frekvens. Dessa förhållanden (elektrodfärg, elektrodform och fotoledande material) kan ge ytterligare parametrar för att detektera heterogenitetsnivån i hMSC-prover.
Slutligen jämfördes resultaten av LiDEP-bedömningen med resultaten från 3DEP-analysatorn som ett riktmärke för hMSC DEP-beteende. En skillnad i frekvensområdet för hMSC:s positiva DEP-respons observerades, men trenderna i de data som samlats in via LiDEP och 3DEP-analysatorn var totalt sett likartade (dvs. det positiva DEP-svaret minskade med ökad frekvens). När växelströmsfältet tillfördes LiDEP-chipet och ljus projicerades på det, sjönk konduktansen i området inom ljusprojektionen, vilket skapade ett ojämnt elektriskt fält. Därför påverkar ljuskällans egenskaper (dvs. intensitet och våglängd) det förväntade svaret hos cellerna i LiDEP-chipet, vilket framgår av resultaten av spännings- och elektrodfärgvariationstesterna. Andra parametrar som kan modifieras är materialet i det fotoledande skiktet och konduktiviteten hos DEP-buffertlösningen. Som sådan måste de förhållanden som används för att utvärdera cellernas DEP-beteende utvärderas baserat på installationen av LiDEP-systemet. Omvänt, för 3DEP-analysatorn eller andra metoder som använder metallelektroder för att applicera DEP-kraften, är elektrodegenskaperna konstanta och kan inte varieras omedelbart för att anpassa sig till vad som behövs för cellerna som undersöks. Denna variation av det positiva DEP-beteendet kan vara till nytta för framtida forskning om karakterisering av olika celltyper inom hMSC-prover, encellsanalys eller cellsortering. Dessutom, när cellerna rör sig längre bort från de virtuella elektroderna, blir växelströmsfältet svagare. Men med 3DEP-analysatorn eller andra traditionella DEP-lägen som använder metallelektroder kan ett större elektriskt fältområde appliceras, vilket gör att fler celler kan manipuleras. Därför upplevde färre celler per LiDEP-experiment effekterna av det elektriska växelströmsfältet i LiDEP-chipets mikrokanal. Ytterligare avvikelser kan orsakas av förändringar i enhetens prestanda över tid (dvs. 2 timmar eller 3 timmar), vilket fortfarande undersöks. Det konstanta flödet av vatten, etanol och DEP-buffertlösning kan bryta ner ytan på mikrokanalskiktet (dvs. det fotoledande materialet) och måste beaktas. Enhetens prestanda över tid för cellkarakterisering måste också beaktas för utökad användning av ett LiDEP-chip. Modifieringar av experimentparametrarna i realtid tog bara några sekunder till minuter. Elektrodfärgen och geometrierna justerades omedelbart med hjälp av inställningar i grafikredigeringsprogrammet.
Sammanfattningsvis visar denna artikel LiDEP: s förmåga att manipulera och karakterisera en cellinje med heterogena cellpopulationer såsom hMSC. Med hjälp av denna inställning och det beskrivna protokollet kunde vi uppnå en framgångsrik karakterisering av hMSC under förhållandena 20 Vpp och projicerade virtuella gula elektroder. Framtida studier bör fokusera på att justera exponeringstiden för hMSC till det elektriska växelströmsfältet som skapas via LiDEP, öka ljusintensiteten hos de virtuella elektroderna och bedöma olika källor till hMSC (eller andra stamcellspopulationer) för att utveckla en LiDEP-katalog över de elektriska signaturerna hos heterogena stamcellspopulationer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. Vi vill tacka Mo Kebaili från UCI:s Integrated Nanosystems Research Facility (INRF). Dessutom vill vi tacka Dr. Devin Keck för att ha hjälpt till med utvecklingen av LiDEP-systemet.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
10x objective | AmScope | — | Ordered from Amazon. |
Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
Dextrose | Fisher | D16-1 | This is glucose. |
Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | — | |
Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
Molybdenum | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | |
Phenol Red | Sigma | P5530 | |
Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
Projector | Vecupoi | — | Ordered from Amazon. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
Trypsin Neutrilizer | Gibco | R002100 | |
Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |