Här presenterar vi en optimerad in vitro-metod för att avslöja, kvantifiera och validera proteininteraktorer av specifika RNA-sekvenser , med hjälp av totalt proteinextrakt från humana celler, streptavidinpärlor belagda med biotinylerat RNA och masspektrometrianalys.
Protein-RNA-interaktioner reglerar genuttryck och cellulära funktioner på transkriptionell och posttranskriptionell nivå. Av denna anledning är identifiering av bindningspartnerna för ett RNA av intresse fortfarande av stor betydelse för att avslöja mekanismerna bakom många cellulära processer. RNA-molekyler kan dock interagera tillfälligt och dynamiskt med vissa RNA-bindande proteiner (RBP), särskilt med icke-kanoniska. Därför finns det ett stort behov av förbättrade metoder för att isolera och identifiera sådana RBP.
För att identifiera proteinpartnerna i en känd RNA-sekvens effektivt och kvantitativt utvecklade vi en metod baserad på pull-down och karakterisering av alla interagerande proteiner, med utgångspunkt från cellulärt totalt proteinextrakt. Vi optimerade proteinneddragningen med hjälp av biotinylerat RNA förladdat på streptavidinbelagda pärlor. Som ett bevis på konceptet använde vi en kort RNA-sekvens som är känd för att binda det neurodegenerationsassocierade proteinet TDP-43 och en negativ kontroll av en annan nukleotidkomposition men samma längd. Efter att ha blockerat pärlorna med jäst-tRNA laddade vi de biotinylerade RNA-sekvenserna på streptavidinpärlorna och inkuberade dem med det totala proteinextraktet från HEK 293T-celler. Efter inkubation och flera tvättsteg för att avlägsna ospecifika bindemedel eluerade vi de interagerande proteinerna med en högsaltlösning, kompatibel med de vanligaste proteinkvantifieringsreagenserna och med provberedning för masspektrometri. Vi kvantifierade anrikningen av TDP-43 i neddragningen utförd med det kända RNA-bindemedlet jämfört med den negativa kontrollen med masspektrometri. Vi använde samma teknik för att verifiera de selektiva interaktionerna mellan andra proteiner som beräkningsmässigt förutspåddes vara unika bindemedel för vårt RNA av intresse eller för kontrollen. Slutligen validerade vi protokollet med western blot via detektion av TDP-43 med en lämplig antikropp.
Detta protokoll kommer att möjliggöra studier av proteinpartnerna i ett RNA av intresse för nära fysiologiska förhållanden, vilket hjälper till att avslöja unika och oförutsägbara protein-RNA-interaktioner.
RNA-bindande proteiner (RBP) har framträtt som avgörande aktörer i transkriptionell och posttranskriptionell genreglering, eftersom de är involverade i processer som mRNA-splitsning, RNA-cellulär lokalisering, translation, modifiering och nedbrytning 1,2,3. Sådana interaktioner mellan de två makromolekylerna är mycket samordnade, exakt balanserade och väsentliga för bildandet av funktionella och bearbetningsnav. Variationer eller dysreglementen inom dessa nav har potential att störa de finreglerade protein-RNA-nätverken och är alltmer associerade med en mängd olika mänskliga sjukdomar, inklusive cancer 4,5 och neurodegenerativa störningar 6,7,8. Interaktionerna mellan RNA-molekyler och deras proteinbindande partners kan vara antingen stabila och lätta att validera experimentellt, eller mycket dynamiska, övergående och svårare att karakterisera.
Under de senaste åren har intensiva ansträngningar gjorts för att förstå dessa interaktioner. Bland de mest etablerade metoderna är proteinpull-down-analyser (PD) förmodligen de mest uppskattade och vanliga metoderna för att avslöja de viktigaste aktörerna som utgör ribonukleoproteinkomplex (RNP) och andra protein-RNA-interaktionsnätverk 3,9,10. PD inkluderar ett brett paraply av informativa tekniker, såsom immunoprecipitation av antingen RNA (RIP)11,12 eller proteinet (CLIP)13,14 av intresse. Några av dessa RNA-PD-protokoll använder ett känt RNA som bete för proteiner15, oftast genom att dra nytta av taggar med hög affinitet som biotin. I detta fall kan interaktionspartnerna för ett biotinylerat RNA detekteras genom att förankra RNA på streptavidinbelagda pärlor, vilket möjliggör effektiv isolering av RNP: erna. De viktigaste begränsningarna med dessa tillvägagångssätt är vanligtvis utformningen av de biotinylerade sonderna och testningen av deras förmåga att binda målproteiner. För detta ändamål kan det vara användbart att förlita sig på publicerade CLIP-data för proteinet av intresse, om sådana finns, eftersom de med hög precision avslöjar de korta RNA-regioner som motsvarar toppar av interaktioner med målproteinet13,16. Samma regioner kan användas för att utveckla sonder för PD. En alternativ metod för att designa sådana RNA-beten kan vara systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX)17, vilket möjliggör design av aptamerer genom in vitro-urval, med utgångspunkt från ett omfattande randomiserat bibliotek och via en serie PCR-drivna optimeringscykler. SELEX är dock komplext och tidskrävande, och de slutliga resultaten är mycket beroende av det ursprungliga biblioteket. För att välja RNA-betet att använda i protokollet som presenteras här utnyttjades ännu ett tillvägagångssätt, bestående av att använda ett RNA-bete designat de novo med hjälp av beräkningskraften hos algoritmkatten RAPID, som förutsäger preferensbindningen av ett givet protein mot vissa RNA-sekvenser18,19,20.
Protokollet som introduceras här är en version av en RNA-PD optimerad för att eluera specifika proteinpartners under nära fysiologiska förhållanden, utan användning av tvättmedel, denatureringsmedel eller höga temperaturer. Det bygger på nano-superparamagnetiska pärlor kovalent belagda med högrenad streptavidin och användningen av ett specifikt in silico-designat biotinylerat RNA som bete. Detta protokoll ger en snabb och effektiv metod för att isolera bindningspartnerna för biotinylerade RNA-molekyler under naturliga förhållanden, vilket ger potential för ett brett spektrum av nedströmsapplikationer. För att testa detta protokoll användes en 10-nukleotid enkelsträngad RNA-aptamersekvens, tidigare utformad för att binda proteinet TAR DNA-bindande protein 43 (TDP-43) med hög affinitet och specificitet,20. Med utgångspunkt från HEK 293T-celllysater identifierades interaktorerna för den biotinylerade RNA-aptameren med hjälp av masspektrometrianalys utförd på prover som lossnat från RNA-betet med hjälp av en hypertonisk buffert. Denna analys bekräftade den framgångsrika identifieringen och kvantifieringen av TDP-43 som föredraget bindemedel.
Detta protokoll möjliggör framgångsrik identifiering av proteininteraktorer med endast en kort, in vitro syntetiserad RNA-oligonukleotid. Dessutom garanterar användningen av in silico-designade RNA-aptamerer som PD-sonder21,22 specificitet för målen till avsevärt reducerade kostnader.
Detta arbete rapporterar optimering av ett PD-protokoll utfört med biotinylerade RNA-oligonukleotider för att fånga deras proteininteraktorer. Protokollet som beskrivs här är enkelt att utföra, kräver lite material och ger mycket tillförlitliga resultat. Viktigt är att de mest nya aspekterna av detta protokoll består av användningen av ett RNA-bete utformat helt i silico och specifikt för proteinmålet och elueringen av alla proteiner bundna till RNA-betet genom att direkt störa deras interaktioner med en högsaltlösning, snarare än genom att dissociera streptavidin från biotinet med tvättmedel och högtemperaturbehandling.
Detta protokoll utnyttjar styrkan i bindningen mellan biotin och streptavidin29,30. Enligt de valda streptavidinpärlorna måste laddningen av det biotinylerade RNA testas och kvantifieras innan man fortsätter. RNA-tredimensionell vikning kan också påverka laddningseffektiviteten på pärlorna, eftersom det kan begränsa exponeringen av biotinet för streptavidin. Blockering av pärlorna med icke-biotinylerat tRNA förbättrar resultatens renhet genom att begränsa ospecifika interaktioner med pärlorna. Belastningsbufferten och elueringsbufferten måste väljas beroende på tillämpningar nedströms. Här föreslogs mycket milda förhållanden, lämpliga för de flesta applikationerna och utvecklade för att bevara potentiella proteinkomplex. Denna metod är dock mycket anpassningsbar; användaren kan välja vilken cellinje som helst och vilken RNA-storlek som helst och kan bestämma sig för att upprepa protokollet efter vikning / utveckling av RNA för att bestämma strukturens effekt på bindningsegenskaperna.
En annan ursprunglig aspekt av detta protokoll är användningen av in silico-prediktionsverktyg för att säkerställa att resultaten är korrekta20. Att veta i förväg vilka proteiner som ska identifieras som interaktorer av RNA av intresse ger den oöverträffade fördelen att validera de tekniska aspekterna av protokollet. Med hjälp av en enkel WB-analys är det till exempel möjligt att verifiera närvaron av ett känt proteinmål i proverna härledda från de olika stegen i protokollet innan man fortsätter med MS-analysen, vilket kräver specialiserad instrumentering och är dyrare. Dessutom rapporterades nyligen en metod för att använda catRAPID20, en intern protein-RNA-prediktionsalgoritm, för att designa de novo RNA specifikt för ett målprotein. Fram till nyligen var den enda tillgängliga pipelinen för att designa DNA/RNA-aptamerer för ett målprotein SELEX-metoden (systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning)31. In silico-metoden möjliggör en mycket snabbare och kostnadseffektiv design av RNA-aptamerer.
De viktigaste begränsningarna för denna metod är förknippade med behovet av att arbeta i nukleasfria buffertar och verktyg. Om det anses nödvändigt att in vitro bekräfta bindningen mellan ett de novo-designat RNA och ett målprotein före PD, måste proteinet produceras och renas och bindningen bestämmas med biofysikaliska metoder. Detta är en begränsning som delas med produktionen av monoklonala antikroppar.
Trots dessa mindre problem kan tillförlitliga metoder för att kartlägga RNA-proteininteraktioner, som den som presenteras här, föra forskare närmare att avslöja makromolekylära nätverk och komplexa huvudaktörer för många fysiologiska och patologiska mekanismer, såsom de som är involverade i cancer, kardiomyopatier, diabetes, mikrobiella infektioner och genetiska och neurodegenerativa störningar.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Prof. Tartaglias och Dr. Cuomos forskargrupp för det stöd som erbjudits. E.Z. fick finansiering från MINDED-stipendiet i Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtalet nr 754490.
6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
Equipment | |||
ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
Software | Version | ||
MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
Perseus | 1.6.14.0 | MS |