Detta protokoll gör det möjligt att avslöja effekten av profetior på deras värdar. Bakteriekulturer synkroniseras med hjälp av förhållanden som bäst stöder det lysogena tillståndet, vilket begränsar spontan induktion. RT-qPCR skiljer entydigt profagbegränsade gener och de som inte är kopplade till fagkontroll från de som uttrycks under den lytiska replikationscykeln.
Tempererade fager finns integrerade som profager i de flesta bakteriegenom. Vissa profager är kryptiska och fixerade i bakteriekromosomen, men andra är aktiva och kan utlösas till replikativ form antingen spontant eller genom exponering för inducerande faktorer. Profager förknippas ofta med förmågan att ge toxinproduktion eller andra virulensassocierade egenskaper till sin värdcell. Nyare studier har visat att de kan spela en mycket större roll för att förändra fysiologin hos sina värdar. Tekniken som beskrivs här har gjort det möjligt för oss att undersöka hur profager påverkar genuttrycket hos den opportunistiska bakterien Pseudomonas aeruginosa.
I detta arbete jämfördes tillväxten av vildtypsstammen P. aeruginosa PAO1 med tillväxten av isogena lysogener som bär på olika kombinationer av profager från Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. I en lysogenodling kommer en andel bakterieceller att stödja lytisk bakteriofagreplikation (spontan induktion) med en hög uttrycksnivå per cell av sena faggener, såsom de som är associerade med sammansättningen av fagpartiklar, och på så sätt maskera det lågnivågenuttryck som är associerat med lysogenbegränsat genuttryck. Effekten av spontan induktion kan således skymma prophagens genuttryck i en lysogenpopulation.
Tillväxtprofileringsexperiment användes för att identifiera spontan induktion, som var minimal under den tidiga exponentiella tillväxtfasen. Denna studie rapporterar hur man förbereder provkulturer under den tidiga exponentiella tillväxtfasen och hur man sätter upp adekvata kontroller trots lågt cellantal. Dessa protokoll säkerställer en tillförlitlig och reproducerbar jämförelse av vildtypsbakterier och lysogena bakterier under olika förhållanden, vilket förbättrar den transkriptomiska profileringen av profaggenomen och hjälper till att identifiera tidigare okända profagfunktioner.
På senare tid har fagterapi för att bekämpa antimikrobiell resistens1 och CRISPR-Cas-baserad genredigering2 skapat förnyat intresse för bakteriofagforskning. Återigen har framsteg inom bioteknik möjliggjort en djupare undersökning av interaktionerna mellan bakterier och fager3. Den terapeutiska användningen av fager (“fagterapi”) hämmas dock av farhågor om att fager fungerar som rörliga genetiska element med kapacitet att överföra virulens- och resistensgener horisontellt4. Utbredningen av “mörk materia”5 (gener med okända funktioner) är både oroande och lockande. Mörk materia anses vara en lucka i vår förståelse av fagbiologi och en i stort sett outnyttjad resurs för molekylära verktyg och potentiella nya terapier6. Utvecklingen av sekvenseringstekniker med hög genomströmning, tillsammans med förbättrad genannotering 7,8,9 och nya peptidveckningsalgoritmer10, förbättrar detektion, beskrivning och funktionell förutsägelse av faggener. Vetenskapen är dock fortfarande långt ifrån att validera de flesta fagers genfunktioner i kulturen eller i den verkliga världen.
RNA-sekvensering (RNA-Seq) kan globalt kartlägga genuttryck under faginfektion och har avsevärt förbättrat förståelsen av både- och bakterieelement som är involverade i lytiska och lysogena cykler11,12. Under lysogena processer integreras tempererade faggenom i bakteriellt DNA för att bli profager13. Experiment med global genuttrycksprofilering kan användas för att identifiera profagbegränsade gener som kodas på tempererade faggenom men som endast uttrycks under det lysogenatillståndet. Sådana gener kodar inte för fagstrukturella proteiner och är inte involverade i några faginfektionsprocesser. RNA-Seq kan användas för att identifiera de gener som är mer benägna att påverka bakterievärdens biologi, antingen genom att inducera en funktionsökning eller genom att reglera de befintliga bakteriegenerna, vilket ofta gör det möjligt för bakterierna att anpassa sig till förändrade miljöer. Därför kan profagers förmåga att fungera som mikrobiella marionettmästare, som kontrollerar en rad bakteriella funktioner, studeras.
Det finns två stora hinder för en effektiv analys av profagbegränsat genuttryck. För det första är tillgången på mottagliga värdar en nyckelfråga. Per definition är profager redan inkorporerade i deras specifika värdgenom, så det är utmanande att hitta en mottaglig vildtypsvärd för att jämföra det globala genuttrycket i närvaro och frånvaro av profagen. Detta kan åstadkommas antingen genom nyinfektion av en annan mottaglig värd eller genom att profagen avlägsnas från det ursprungliga vildtypsisolatet, utan att resten av värdgenomet störs. Det andra hindret ligger i den heterogena karaktären hos lysogena populationer. Vissa profager bryts ned genom mutation eller rekombination för att bli “kryptiska”, vilket innebär att de är fixerade på en specifik plats i bakteriegenomet. Andra profager är dock “aktiva” och kan induceras i en replikativ, lytisk cykel spontant eller efter exponering för inducerande faktorer. I många lysogena kulturer innebär den spontana induktionshastigheten att en del av bakteriecellerna alltid genomgår lytisk fagreplikation14,15,16. En hög nivå av uttryck av sena faggener i dessa populationer maskerar det låga genuttrycket som är associerat med lysogenbegränsat genuttryck11,17. Andelen lysogener som genomgår spontan profaginduktion kan variera med tillväxttillståndet, tillväxtförhållandena eller andra utlösande faktorer. Därför, för att studera effekterna av profager på lysogenet, måste spontana profaginduktionshändelser minimeras så mycket som möjligt genom att optimera tillväxtförhållandena för att gynna det lysogena tillståndet.
Denna studie redovisar det förberedande arbete som gjorts för att undersöka påverkan av en uppsättning samboende profager från Liverpool Epidemic Strain (LES) av Pseudomonas aeruginosa. Aktiva profager inducerades och isolerades från LES och användes för att infektera värdstammen av modell P. aeruginosa, PAO116,18,19. Hela genomet hos vildtypsstammen av P. aeruginosa, PAO1, och dess lysogen, PAO1Φ2, sekvenserades (på ett djup av 30x täckning) för att säkerställa identiteten hos vildtypsstammen och för att bekräfta att lysogenen var isogen. LES har associerats med ökad morbiditet och mortalitet hos patienter med cystisk fibros, och LES-fager 19 har föreslagits för att underlätta anpassning till lungmiljön med cystisk fibros16,19,20. Trots starka bevis för att dessa profager påverkar biologin hos deras värd20,21, är majoriteten av deras genfunktioner ännu inte karakteriserade, och de specifika mekanismerna för interaktion är dåligt förstådda. En transkriptomikmetod kan empiriskt avslöja profaggenens funktioner i en kontrollerad värdbakgrund. Eftersom spontan induktion kan påverka uttrycksprofiler beskriver den här artikeln hur man optimerar tillväxtförhållandena för att gynna det lysogena tillståndet. Sådan synkronisering av kulturer kan valideras med realtids-PCR för att kvantifiera uttrycksnivåerna av viktiga genetiska markörer som är associerade med avgörande steg av LES-fagreplikation i PAO1. Samma tillvägagångssätt har tidigare använts för att identifiera de profagbegränsade funktionerna hos Shiga-toxigenic fager som påverkar motilitet, syraresistens och antimikrobiell resistens i Escherichia coli11,17,21,22.
Skapandet av en valbar indikatorvärd, som tidigare använts i plackanalyser för att mer exakt kvantifiera den spontana induktionen av Stx-från E. coli MC106137,38,39, har beskrivits här för P. aeruginosa- LESΦ2. Denna intervention har den extra fördelen att den minskar provbearbetningsstegen och tiden, vilket möjliggör samtidig bedömning av spontana induktionshastigheter under flera odlingsförhållanden. Det finns en risk för att andra mutationer genereras under skapandet av rifampicinresistenta varianter40; I detta arbete användes dock den utvecklade stammen endast som en indikatorvärd för räkning av plack från kulturer av intresse och inkluderades inte i den transkriptomiska analysen. Så länge den valbara indikatorstammen förblir lika mottaglig för infektion av fagen av intresse, finns det ingen oro för andra förvärvade mutationer. Trots detta upptäcktes inga skillnader i polymorfismprofilerna för restriktionsfragmentets längd genom pulsfältsgelelektrofores (PFGE) analys av PAO1WT och PAO1RIF (data visas inte).
När man väljer värdceller är det sällsynt att hitta en indikatorstam som inte redan hyser prophager. Som ett exempel härbärgerar PAO1 den filamentösa profagen Pf4. De experimentella kontrollerna för denna studie var utformade för att direkt kunna undersöka genuttrycket hos specifika fager (i detta fall LES prophage 2) och de effekter denna har på bakteriellt genuttryck. I jämförelsen av transkript från PAO1 som bär LES-profag 2 och saknar LES-profag 2 (både lysogen och icke-lysogen bär på det endogena Pf4), som fungerar som interna kontroller för att utesluta effekten av Pf4 på värden. Dessutom har det visats att Pf4 vanligtvis inte orsakar lys i sin värdcell41 och därför inte kan förvirra resultaten av dessa experiment.
Det är väl etablerat att noggrann kvalitetskontroll är avgörande vid provberedning för att producera meningsfulla omics-data42. Som tidigare beskrivits11 utförs dock sällan den noggranna karakteriseringen av profagaktivitet vid beredning av lysogenkulturer för sådana studier. Här beskriver vi våra systematiska protokoll för att förbereda en välkontrollerad och optimerad uppsättning kulturer för transkriptomiska studier för att bättre utforska interaktionerna mellan bakterier och tempererade fager. Populationens synkronicitet kontrollerades genom att kulturen genomgick minst fyra fördubblingar innan den behandlades med det inducerande antibiotikumet norfloxacin. Genom att bestämma MIC för norfloxacin för stammen i studien kunde vi säkerställa att koncentrationen av induceringsmedlet låg strax över MIC för “induktionsbehandlingen”. De behandlade cellerna späddes sedan 1:10 för att sänka norfloxacinkoncentrationen under MIC efter 1 timmes behandling för att cellerna skulle kunna återhämta sig och slutföra fagreplikationsprocessen, vilket slutade med att cellen lyserades och att infektiös fagavkomma frigjordes. Cellerna går in i den lytiska replikationscykeln först efter induktionsstimulus när koncentrationen av norfloxacin har förts under MIC under återhämtningsperioden. I detta fall innebär ett överskott av 1 μg·ml−1 norfloxacin att läkemedlet inte effektivt kan spädas ut under MIC, eftersom MIC för norfloxacin för PAO1 är 0,19 μg·ml−1. Graden av inducerspädning måste vägas mot behovet av återvinning av lysogen och bibehållande av odlingstätheten för att skörda RNA. De data som diskuteras här visar att det är möjligt att synkronisera kulturer för att skapa prover där lysogeni dominerar, vilket minskar bruset från spontan induktion och möjliggör detektion av verkliga lysogenidrivna förändringar i genuttryck. Eftersom det lysogena tillståndet är dominerande i den tidiga exponentiella tillväxtfasen när bakteriecelltätheten är låg, föreslår vi att man skalar upp kulturerna för att skörda tillräckligt med RNA för efterföljande genuttrycksstudier såsom RNA-Seq.
Användningen av norfloxacin som ett inducerande medel för att tvinga in kulturer i den lytiska cykeln är välrapporterad43,44; Detta kommer dock också att påverka uttrycket av andra bakteriegener i processen45,46. För att mildra detta bör RNA-bibliotek från kontrollkulturer av vildtyp som odlats under samma inducerande och icke-inducerande förhållanden inkluderas i RNA-Seq-experiment. Användningen av interna kontroller och nyckelmarkörgener för att validera stadierna av fagreplikation med qRT-PCR är också avgörande för korrekta jämförelser. Kvantitativ RT-PCR-profilering kan inte tolkas genom att jämföra det absoluta antalet transkript för varje gen vid olika tidpunkter; Det är profilens form som spelar roll. För det första har endast en liten region i transkriptet för någon gen provtagits, så om det är ett kortlivat eller mer långlivat elementär okänt. Visst visar RNA-Seq-kartläggning av transkript att densiteten av kartläggningsdata varierar avsevärt över längden på en gen. För det andra är det formen på genuttrycksprofilen som bör tolkas för en markörgen som är associerad med den lytiska cykeln eller den lysogena livsstilen eller till och med frikopplad från fagregleringskretsarna11. Spontan induktion är ett verkligt problem i lysogenodling och kommer alltid att resultera i uttryck av lytiska cykelassocierade gener. Profilering visar dock att de gener som är associerade med den lytiska replikationscykeln undertrycks i sitt uttryck före induktion (minst två logaritmiska veck) och uppreglerat efter induktion.
De tidigare genomförda transkriptomiska analyserna av Stx-faginteraktioner med E. coli stöder en grundlig förståelse av faggenerna som är involverade i att upprätthålla lysogeni och utlösa den lytiska cykeln11,17. För närvarande har LES-fagerna hos P. aeruginosa annoterats, men deras viktigaste genfunktioner är mindre väl kända. Transkriptomiska studier kommer att göra det möjligt att på nytt annotera LES-profagerna och förbättra vår förståelse av de gener som är involverade i lysogeni- och lytcykeln. Att koppla gensekvens till funktion utgör en stor utmaning i studiet av nya profager, vilket ytterligare belyser behovet av fler studier för att bekräfta faggenens funktioner för produktion av bättre annoteringsverktyg47. Den bredare tillämpningen och anpassningen av protokollen och extra kvalitetskontrollåtgärder som beskrivs i den här videoartikeln kan hjälpa till att avslöja olika profagfunktioner och därmed förbättra annoteringspipelines och förändra vår förståelse av- och bakteriebiologi.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |