Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl3 aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kardiyovasküler hastalıklar tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir. Anormal tromboz, diyabet ve obezite gibi sistemik durumların ve ateroskleroz, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi kronik inflamatuar hastalıkların ortak bir özelliğidir. Vasküler yaralanma üzerine, genellikle pıhtılaşma sistemi, trombositler ve endotel, yaralanma bölgesinde bir pıhtı oluşturarak kanamayı önlemek için düzenlenmiş bir şekilde hareket eder. Bu süreçteki anormallikler ya aşırı kanamaya ya da kontrolsüz tromboza / yetersiz antitrombotik aktiviteye yol açar, bu da damar tıkanıklığına ve sekellerine dönüşür. FeCl3 ile indüklenen karotis hasar modeli, trombozun in vivo olarak nasıl başladığını ve ilerlediğini araştırmak için değerli bir araçtır. Bu model endotel hasarı/denudasyonu ve ardından yaralanan bölgede pıhtı oluşumunu içerir. Farklı derecelerde vasküler hasara yanıt olarak vasküler hasarı ve pıhtı oluşumunu izlemek için oldukça hassas, kantitatif bir tahlil sağlar. Optimize edildikten sonra, bu standart teknik, trombozun altında yatan moleküler mekanizmaları ve ayrıca büyüyen bir trombüsteki trombositlerdeki ultrayapısal değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu tahlil aynı zamanda antitrombotik ve antiplatelet ajanların etkinliğini incelemek için de yararlıdır. Bu makalede, FeCl3 ile indüklenen arteriyel trombozun nasıl başlatılacağı ve izleneceği ve elektron mikroskobu ile analiz için örneklerin nasıl toplanacağı açıklanmaktadır.
Giriş
Tromboz, bir kan damarını kısmen veya tamamen bloke eden ve kanın doğal akışını engelleyen bir kan pıhtısı oluşumudur. Bu, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi ciddi ve ölümcül kardiyovasküler olaylara yol açar. Kardiyovasküler hastalıklar morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve dünya çapında her dört ölümden birine neden olmaktadır 1,2,3. Tromboz, vasküler sistemin bir arızası olarak ortaya çıkmasına rağmen, altta yatan bir mikrobiyal veya viral enfeksiyon, bağışıklık bozukluğu, malignite veya metabolik durumun bir sonucu olabilir. Kan akışı, endotel hücreleri, kırm....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada tartışılan tüm deneyler, Kentucky Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
NOT: Cerrahi aletler Şekil 1 ve Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. C57BL/6J fareler, 8-10 haftalık, erkek/dişi veya ilgili genetik olarak manipüle edilmiş (Nakavt veya Knockin) suşlar kullanıldı.
1. FeCl3'e bağlı karotis arter yaralanması
- Fare anestezi indüksiyonu
- Fareyi tartın.
- İntraperitoneal olarak 0,2 g/kg tribromoetanol çözeltisi enjekte ederek fare....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Veriler genellikle oklüzyona kadar geçen süre veya tamamen tıkayıcı bir trombüs oluşturmak için gereken süre olarak sunulur. Bu veriler bir Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi (Şekil 4A)19, kan akışının durması veya bir deneyin sona ermesi sırasında terminal kan akışını gösteren çubuklu bir nokta grafiği (Şekil 4B) veya bir çizgi grafik (Şekil 4C) olarak çizilebilir. Trombüs stabilitesi bu teknik kullanılarak i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
FeCl3'ün trombozu indüklemek için vaskülatüre topikal olarak uygulanması yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve çeşitli trombosit reseptörleri, ligand sinyal yolları ve bunların inhibitörleri20,21,22,23 için roller belirlemede etkili olmuştur. FeCl3'ün tromboza neden olduğu mekanizma çok yönlüdür; Önceden, endotel denudasyonu trombozun bir nedeni olarak kabul edildi, an.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması yoktur.
ORCID profilleri: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Teşekkürler
Yazarlar, Whiteheart Laboratuvarı üyelerine bu makaleyi dikkatli bir şekilde inceledikleri için teşekkür eder. Çalışma, NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ve HL150818) hibeleri ve S.W.W.'ye Gazi İşleri Bakanlığı Liyakat Ödülü, B.S.'ye R01 HL 155519 ve R.D.L.'ye NIBIB intramural program hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.9 Salin | Fisher Bilimsel | BP358-212 | NaCl,% 0.9 tuzlu su çözeltisi yapmak için kullanılır; |
| 1 mL Şırınga | Becton, Dickinson ve Şirketi | ||
| 190 Dayanıklı Etanol | KOPTEC | V1101 | Fareyi ameliyata hazırlamak için %70'lik bir etanol çözeltisi yapmak için kullanılır |
| 2,2,2 Tribromoetanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Siyah Örgülü İpek Sütür (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 İğne | Becton, Dickinson ve Şirketi | 305110 | |
| 2-metil-2-bütanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL transfer pipeti, 3 mL'ye derecelendirildi | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alkol Hazırlama Pedleri (%70 İzopropil Alkol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 10900 | |
| Hücre Kültürü Kabı 35mm X 10mm | Corning Anonim Şirketi | ||
| Kompakt Tartı | Ward'ın Bilimi | 470314-390 | |
| Diseksiyon Makası, 12,5 cm uzunluğunda | Dünya Hassas Aleti | 15922-G | |
| DMP-30 aktivatör | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 13600 | |
| Dodenil Süksinik Anhidrit / DDSA | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 13700 | |
| Köpek Kaka Torbaları / hayvan karkas imha çantası | Taç Ürünleri | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonik Sistemler A.Ş. | MA0.5PSB | |
| GÖMME 812 reçine ve nbsp; | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 14900 | |
| Etil Alkol, susuz 200 kanıt | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 15055 | |
| Göz Sargısı Forseps, 4" Tam Kavisli, Standart, 0.8mm Geniş Uçlar | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filtre Kağıdı | VWR | 28310-106 | |
| İnce Makas - Keskin-Kör | İnce Bilim Aletleri | 14028-10 | |
| Parmak Döngü Kulak Zımbaları | Güzel Bilim Araçları | 24212-01 | |
| Gazlı Bez Süngerler 2 "x 2" & ndash; 12 Katlı | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehit (%10 çözelti) | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 16120 | |
| Integra Miltex Karbon Çelik Cerrahi Bıçak #10 | Integra® Milteks® | 4110 | |
| Demir (III) Klorür | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Bıçak Sapı Miltex® Ekstra İnce Paslanmaz Çelik Boyut 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartik asit | Sigma Balıkçı | A93100 | |
| L-aspartik asit | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Kurşun Nitrat | Fisher Bilimsel | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Mikroskop | LEICA | artık mevcut değil | şirketten temin edilemiyor |
| LEICA S8AP0 Mikroskop Standı | LEICA | 10447255 | şirketinden temin edilememektedir |
| . | VWR | 82003-822 | |
| Mikro Diseksiyon Forsepsleri; 1x2 Diş, Tam Eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" Uzunluk | Roboz Cerrahi Alet Şirketi | RS-5157 | |
| Osmiyum Tetroksit% 4 sulu çözelti | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 19150 | |
| Paraformaldehit (%16 çözelti) | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 15710 | |
| Potasyum ferrisiyanür | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propilen Oksit, ACS reaktifi | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 20401 | |
| Rainin Klasik Pipet PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Araştırma Debimetresi | Transonik Sistemler A.Ş. | T402B01481 | Modeli: T402 |
| Scotch Magic Görünmez Bant, 3/4 "x 1000", Şeffaf | Scotch | ||
| Küçük Hayvan Isıtmalı Ped | K & H İmalat A.Ş. | Model: HM10 | |
| Sodyum Kakodilat Tamponu 0.2M, pH7.4 | Elektron mikroskobu Hizmetleri | 11623 | |
| Steril Pamuk Uçlu Aplikatörler | Püriten Medikal Ürünler | 25-806 1WC | |
| Steromaster Aydınlatıcı | Fisher Bilimsel | 12-562-21 | Artık |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Güzel Bilim Araçları | 11271-30 | |
| Tiyokarbohidrazid (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Evrensel Düşük Tutmalı Pipet Ucu Yeniden Yüklemeleri (0.1-10 & mikro; L) | VWR | 76323-394 | |
| Uranil Asetat Elektron | mikroskobu Hizmetleri | 22400 | |
| Veet Jel Krem Saç Çıkarıcı | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| Beyaz Antistatik Altıgen Tartı Tekneleri, Orta, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Yazılımı | DATAQ Instruments, Inc. | Sürüm 3.38 | Ücretsiz olarak indirilebilir. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Kaynaklar
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
