JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64989
, , ,
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas,Universidade de Sao Paulo

Summary

Hier presenteren we een protocol om een pleisterklem van hele cellen uit te voeren op hersenplakken die kisspeptine-neuronen bevatten, de primaire modulator van gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) -cellen. Door kennis toe te voegen over de activiteit van kisspeptine-neuronen, heeft dit elektrofysiologische hulpmiddel de afgelopen 20 jaar als basis gediend voor aanzienlijke vooruitgang op het gebied van neuro-endocrinologie.

Abstract

Kisspeptinen zijn essentieel voor de rijping van de hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as en vruchtbaarheid. Hypothalamische kisspeptine-neuronen in de anteroventrale periventriculaire kern en rostrale periventriculaire kern, evenals de boogvormige kern van de hypothalamus, projecteren op gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) neuronen, naast andere cellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat kisspeptine-signalering plaatsvindt via de Kiss1-receptor (Kiss1r), uiteindelijk opwindende GnRH-neuronactiviteit. In menselijke en experimentele diermodellen zijn kisspeptinen voldoende voor het induceren van GnRH-secretie en bijgevolg luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) afgifte. Omdat kisspeptinen een essentiële rol spelen in reproductieve functies, werken onderzoekers eraan om te beoordelen hoe de intrinsieke activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen bijdraagt aan reproductiegerelateerde acties en de primaire neurotransmitters / neuromodulatoren te identificeren die in staat zijn om deze eigenschappen te veranderen. De whole-cell patch-clamp techniek is een waardevol hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van kisspeptin neuron activiteit in knaagdiercellen. Deze experimentele techniek stelt onderzoekers in staat om spontane exciterende en remmende ionische stromen, rustmembraanpotentiaal, actiepotentiaal en andere elektrofysiologische eigenschappen van celmembranen vast te leggen en te meten. In de huidige studie worden cruciale aspecten van de whole-cell patch-clamp-techniek, bekend als elektrofysiologische metingen die hypothalamische kisspeptine-neuronen definiëren, en een bespreking van relevante kwesties over de techniek, besproken.

Introduction

Hodgkin en Huxley maakten het eerste intracellulaire record van een actiepotentiaal beschreven in verschillende wetenschappelijke studies. Deze opname werd uitgevoerd op het inktvis-axon, dat een grote diameter heeft (~ 500 μm), waardoor een micro-elektrode in het axon kan worden geplaatst. Dit werk bood grote mogelijkheden voor wetenschappelijk onderzoek, later culminerend in de creatie van de spanningsklemmodus, die werd gebruikt om de ionische basis van actiepotentiaalgeneratie 1,2,3,4,5,6,7,8 te bestuderen. In de loop der jaren is de techniek verbeterd en op grote schaal toegepast in wetenschappelijk onderzoek 6,9. De uitvinding van de patch-clamp-techniek, die plaatsvond in de late jaren 1970 door studies geïnitieerd door Erwin Neher en Bert Sakmann, stelde onderzoekers in staat om enkele ionkanalen en intracellulaire membraanpotentialen of -stromen in vrijwel elk type cel vast te leggen met behulp van slechts een enkele elektrode 9,10,11,12 . Patch-clamp-opnamen kunnen worden gemaakt op verschillende weefselpreparaten, zoals gekweekte cellen of weefselplakken, in spanningsklemmodus (waarbij het celmembraan op een ingestelde spanning wordt gehouden waardoor bijvoorbeeld spanningsafhankelijke stromen en synaptische stromen kunnen worden geregistreerd) of stroomklemmodus (waardoor bijvoorbeeld veranderingen in rustmembraanpotentiaal geïnduceerd door ionenstromen kunnen worden geregistreerd, actiepotentialen en postsynaptische potentiaalfrequentie).

Het gebruik van de patch-clamp techniek maakte verschillende opmerkelijke ontdekkingen mogelijk. Inderdaad, de baanbrekende bevindingen over de elektrofysiologische eigenschappen van hypothalamische kisspeptine-neuronen gelegen op de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV / PeN Kisspeptin), ook bekend als het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel (RP3V), en de boogvormige kern van de hypothalamus (ARHkisspeptin)13,14,15 zijn van bijzonder belang. In 2010 voerden Ducret et al. de eerste opnames uit van AVPV / PeNKisspeptine-neuronenin muizen met behulp van een ander elektrofysiologisch hulpmiddel, de lose-cell patch-clamp-techniek. Deze studies gaven een elektrische beschrijving van AVPV / PeNKisspeptine-neuronen en toonden aan dat hun vuurpatronen afhankelijk zijn van de oestruscyclus-afhankelijke16. In 2011 gebruikten Qiu et al. de hele cel patch-clamp-techniek om aan te tonen dat ARHkisspeptin neuronen endogene pacemakerstromen tot expressie brengen17. Vervolgens toonden Gottsch et al. aan dat kisspeptine-neuronen spontane activiteit vertonen en zowel h-type (pacemaker) als T-type calciumstromen tot expressie brengen, wat suggereert dat ARHkisspeptine-neuronen elektrofysiologische eigenschappen delen met andere pacemakerneuronen van het centrale zenuwstelsel18. Bovendien is aangetoond dat ARHkisspeptine-neuronen seksueel dimorfe vuursnelheden vertonen en dat AVPV / PeNKisspeptine-neuronen een bimodaal rustmembraanpotentiaal (RMP) vertonen dat wordt beïnvloed door ATP-gevoelige kaliumkanalen (KATP)19,20. Bovendien werd vastgesteld dat gonadale steroïden de spontane elektrische activiteit van de kisspeptine-neuronen bij muizen positief beïnvloeden 19,20,21. De eerste werken die de elektrofysiologische eigenschappen van kisspeptine-neuronen bestuderen, worden genoemd 16,17,18,19,20. Sindsdien hebben veel studies de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om aan te tonen welke factoren/neuromodulatoren voldoende zijn om de elektrische activiteit van kisspeptin neuronen te moduleren (Figuur 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Gezien het belang van deze techniek voor de studie van neuronen die nodig zijn voor reproductie, naast andere celtypen die hier niet worden behandeld, beschrijft dit artikel de basisstappen voor de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek van de hele cel, zoals het voorbereiden van de oplossingen, het ontleden en snijden van de hersenen en het uitvoeren van de afdichting van het celmembraan voor opnames. Bovendien worden relevante kwesties over de techniek besproken, zoals de voordelen, technische beperkingen en belangrijke variabelen die moeten worden gecontroleerd voor optimale experimentele prestaties.

Protocol

Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Instituut voor Biomedische Wetenschappen Dierenethiekcommissie aan de Universiteit van São Paulo en werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen van het Braziliaanse College voor Dierproeven. 1. Bereiding van oplossingen Bereiding van interne oplossingOPMERKING: De interne oplossing vult de patchklemmicropipette en maakt contact met het binnenste van de cel (zie een voorbeeld in figuur 2</…

Representative Results

Om de mogelijke effecten van humaan recombinant groeihormoon (hGH) op de activiteit van hypothalamische kisspeptine-neuronen te bestuderen, voerden we hele cel patch-clamp-opnames uit in hersenplakken en beoordeelden we of dit hormoon acute veranderingen veroorzaakt in de activiteit van AVPV / PeN Kisspeptin en ARHkisspeptin neuronen. Volwassen Kiss1-Cre/GFP vrouwelijke (diestrus-stadium) en mannelijke muizen36 werden gebruikt in deze studie. Gonad-intacte dieren werden gese…

Discussion

De ontwikkeling van de whole-cell patch-clamp techniek had een aanzienlijke impact op de wetenschappelijke gemeenschap en werd van het grootste belang geacht voor de ontwikkeling van wetenschappelijk onderzoek en het mogelijk maken van verschillende ontdekkingen. De impact ervan op de wetenschap was voldoende om te culmineren in de Nobelprijs voor de Geneeskunde in 1991, omdat deze ontdekking de deur opende naar een beter begrip van hoe ionkanalen functioneren onder fysiologische en pathologische omstandigheden, evenals …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de São Paulo Research Foundation [FAPESP-subsidienummers: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); en door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Finance Code 001″ (HRV).

Materials

Compounds for aCSF, internal and slicing solutions
ATP Sigma Aldrich/various A9187
CaCl2 Sigma Aldrich/various C7902
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich/various G7021
EGTA Sigma Aldrich/various O3777
HEPES Sigma Aldrich/various H3375
KCL Sigma Aldrich/various P5405
K-gluconate Sigma Aldrich/various G4500
KOH Sigma Aldrich/various P5958
MgCl2 Sigma Aldrich/various M9272
MgSO4 Sigma Aldrich/various 230391
NaCl Sigma Aldrich/various S5886
NaH2PO4  Sigma Aldrich/various S5011
NaHCO3 Sigma Aldrich/various S5761
nitric acid Sigma Aldrich/various 225711 CAUTION
Sucrose Sigma Aldrich/various S1888
Equipments
Air table TMC 63-534
Amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Computer various –
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM Molecular Devices DD1440
Digital peristaltic pump Ismatec ISM833C 
Faraday cage TMC 81-333-03
Imaging Camera Leica DFC 365 FX
Micromanipulator Sutter Instruments Roe-200
Micropipette Puller Narishige PC-10
Microscope Leica DM6000 FS
Osteotome Bonther equipamentos & Tecnologia/various 128
Recovery chamber Warner Instruments/Harvard apparatus – can be made in-house
Recording chamber Warner Instruments 640277
Spatula Fisher Scientific /various FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
Vibratome  Leica VT1000 S
Water Bath  Fisher Scientific /various Isotemp
Software and systems
AxoScope 10 software Molecular Devices – Commander Software
LAS X wide field system Leica – Image acquisition and analysis
MultiClamp 700B Molecular Devices MULTICLAMP 700B Commander Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS Molecular Devices Pclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm Warner Instruments 64-1309
Curved hemostatic forcep various –
cyanoacrylate glue LOCTITE/various –
Decapitation scissors various –
Filter paper various –
Glass capillaries (micropipette) World Precision Instruments, Inc TW150F-4
Iris scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 65-66
Pasteur glass pipette  Sigma Aldrich/various CLS7095B9-1000EA
Petri dish various –
Polyethylene tubing  Warner Instruments 64-0756
Razor blade for brain dissection TED PELLA TEDP-121-1
Razor blade for the vibratome TED PELLA TEDP-121-9
Scissors Bonther equipamentos & Tecnologia/various 71-72, 48,49; 
silicone teat various –
Slice Anchor  Warner Instruments 64-0246
Syringe filters Merck Millipore Ltda SLGVR13SL Millex-GV 0.22 μm
Tweezers Bonther equipamentos & Tecnologia/various 131, 1518
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).

Tags

Whole-cell Patch-clamp RecordingsElectrophysiological PropertiesCell MembranesIonic CurrentsCellular ResponseBrain DissectionHypothalamusOptic NerveVibratomeACSF SolutionMicroscopeAmplifierDigitizerMicromanipulatorPerfusion Pump
check_url/64989?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Silva, J. d. N., Zampieri, T. T., Vieira, H. R., Frazao, R. Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (193), e64989, doi:10.3791/64989 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image