Subdural blød elektrokortikografi (ECoG) arrayimplantation og langvarig kortikal registrering hos minigrise

Summary

Her præsenterer vi en metode til langsigtet præstations- og sikkerhedsvurdering af bløde subdurale elektrodearrays i en minipig-model, der beskriver kirurgisk metode og værktøjer, postoperativ magnetisk resonansbilleddannelse, elektrofysiologi af den auditive cortex, implantatets elektrokemiske egenskaber og postmortem immunkemi.

Abstract

Neurologiske svækkelser og sygdomme kan diagnosticeres eller behandles ved hjælp af elektrokortikografi (ECoG) arrays. I lægemiddelresistent epilepsi hjælper disse med at afgrænse den epileptiske region for at resektere. I langsigtede applikationer såsom hjerne-computer-grænseflader bruges disse epikortikale elektroder til at registrere hjernens bevægelseshensigt til at kontrollere robotlemmerne hos lammede patienter. Imidlertid opfylder de nuværende stive elektrodenet ikke behovet for hjerneoptagelser i høj opløsning og langsigtet biointegration. For nylig er konforme elektrodearrays blevet foreslået for at opnå langsigtet implantatstabilitet med høj ydeevne. Der er imidlertid behov for prækliniske undersøgelser af disse nye implantatteknologier for at validere deres langsigtede funktionalitet og sikkerhedsprofil, så de kan oversættes til humane patienter. I denne sammenhæng anvendes svinemodeller rutinemæssigt til udvikling af medicinsk udstyr på grund af deres store organstørrelser og nemme håndtering af dyr. Imidlertid er kun få hjerneanvendelser beskrevet i litteraturen, hovedsagelig på grund af kirurgiske begrænsninger og integration af implantatsystemet på et levende dyr.

Her rapporterer vi metoden til langtidsimplantation (6 måneder) og evaluering af bløde ECoG-arrays i minipig-modellen. Undersøgelsen præsenterer først implantatsystemet, der består af et blødt mikrofabrikeret elektrodearray integreret med en magnetisk resonansbilleddannelse (MRI)-kompatibel polymer transdermal port, der huser instrumenteringsstik til elektrofysiologiske optagelser. Derefter beskriver undersøgelsen den kirurgiske procedure, fra subdural implantation til dyrebedring. Vi fokuserer på den auditive cortex som et eksempel på et målområde, hvor fremkaldte potentialer induceres af akustisk stimulering. Vi beskriver endelig en dataindsamlingssekvens, der inkluderer MR af hele hjernen, implantatelektrokemisk karakterisering, intraoperativ og frit bevægende elektrofysiologi og immunhistokemisk farvning af de ekstraherede hjerner.

Denne model kan bruges til at undersøge sikkerheden og funktionen af nyt design af kortikale proteser; obligatorisk præklinisk undersøgelse for at forestille sig oversættelse til humane patienter.

Introduction

Neurologiske svækkelser og sygdomme kan diagnosticeres eller behandles ved hjælp af elektrokortikografi (ECoG) arrays. Disse elektrodegitter implanteres på overfladen af hjernen og giver mulighed for optagelse eller stimulering af den menneskelige cortex¹. I tilfælde af lægemiddelresistent epilepsi hjælper de for eksempel med at afgrænse den epileptiske region for at resektere². I langsigtede applikationer såsom hjerne-computer-grænseflader bruges disse epikortikale elektroder til at registrere hjernens bevægelseshensigt til at kontrollere robotlemmerne hos lammede patienter³. Imidlertid er nuværende elektrodegitter lavet af stive metalliske blokke indlejret i stive polymere substrater og imødekommer ikke behovet for hjerneoptagelser med høj opløsning og langsigtet subdural biointegration (>30 dage). De skaber snarere lokale vævsreaktioner, der fører til fibrotisk indkapsling af den implanterede enhed, hvilket fører til dårligere ydeevne over tid. For nylig er fleksible eller strækbare elektrodearrays ved anvendelse af tynde polymere substrater fremstillet ved mikrofabrikationsteknikker blevet foreslået for at opnå høj ydeevne i langsigtede implantationer ved at begrænse vævsreaktionen ^4,5. Der er imidlertid behov for prækliniske undersøgelser af disse nye implantatteknologier for at validere deres langsigtede funktionalitet og sikkerhedsprofil, så man kan forestille sig oversættelse til menneskelige patienter. I denne sammenhæng anvendes minigrise- og svinemodeller rutinemæssigt i udviklingen af udstyr i andre medicinske sammenhænge (f.eks. hjerte-kar-, skelet- eller gastriske systemer) på grund af deres store organstørrelser og nemme håndtering af dyr ^6,7,8. Imidlertid er kun få anvendelser rettet mod hjernen til neurofysiologi beskrevet i litteraturen, hovedsagelig på grund af kirurgiske tilgangsbegrænsninger og integration af implantatsystemet på et levende dyr 9,10,11,12. Disse er ofte ikke kompatible med kronisk implantation i levende dyr, da de f.eks. ville kræve udvikling af kompleks hardware såsom implanterbar indlejret elektronik. Derudover undersøger de ikke implantatsystemets indflydelse på målvævet, hvilket er afgørende for biosikkerhedsaspektet i translationelle undersøgelser. Svinemodellen er tæt på menneskets anatomi med hensyn til kortikal struktur, kranieben og hudtykkelse¹³. Desuden gør deres evne til at lære adfærdsmæssige opgaver dem til en stærk model til undersøgelse af funktionelle rehabiliteringsstrategier eller sensoriske opfattelser¹⁴.

Oversættelse af nye teknologier og terapier til mennesker kræver en vurdering af sikkerhed og virkning som krævet af de kompetente medicinske myndigheder. Disse beskrives normalt i tekniske dokumenter og normer¹⁵, men de kræver kun, at disse test bestås, og undersøger ikke den faktiske virkning af implantationen af enheden eller indsamling af andre nyttige data parallelt med sikkerhedsundersøgelsen. For en komplet biosikkerheds- og præstationsundersøgelse af hjernen præsenterer vi her en langsgående og systematisk indsamling af hjernebilleddannelsesdata, elektrofysiologiske målinger, vurdering af de implanterede elektroders elektrokemiske egenskaber og postmortemhistologi i en svinemodel. For at opnå dette skal flere aspekter overvejes for at skabe en komplet eksperimentel model: (i) minimalt invasiv kirurgisk adgang til implantation af udstyr sammen med en mekanisk stabil transdermal port til tilslutning til elektroderne, (ii) et robust elektrofysiologisk registreringsparadigme, der tjener som ydelsesoutput for de implanterede elektroder både under anæstesi og under frit bevægelige forhold, iii) in vivo-billeddannelse (computertomografi [CT] og/eller magnetisk resonansbilleddannelse [MRI]) på forskellige tidspunkter for at følge hjernens og implantatets udvikling samt det implanterede systems kompatibilitet med billeddannelsesudstyret, og iv) en vævsforberedelsespipeline til ekstraktion af hjernen til histologisk analyse.

Her rapporterer vi om metoden til langtidsimplantation (6 måneder) og evaluering af bløde ECoG-arrays i minipig-modellen (vist skematisk i figur 1). De bløde elektrodearrays blev præsenteret i vores tidligere rapporter og er lavet af tynde silikonemembraner, der indlejrer elastiske guldtynde film, der bruges som elektriske spor^16,17. Kontakten med vævet sker gennem en blanding af platinnanopartikler indlejret i en silikonematrix for en blød og effektiv elektrokemisk grænseflade til hjernevævet¹⁸. Implantaterne er forbundet via et fleksibelt kabel, der er tunneleret subduralt gennem kraniet og huden til en transdermal port, der huser stikkene på dyrets hoved. Implantatets størrelse og form kan tilpasses i henhold til målet og undersøgelsens behov. De nuværende elektrodestrimler i denne undersøgelse afspejler den reelle størrelse af de kliniske strimler. Klinisk tilgængelige subdurale strimler og gitre blev anvendt som komparatorer ved hjælp af samme tilgang. Den polymere MR-kompatible transdermale port placeres på kraniet ved hjælp af et fodpladesystem, der forankrer det fast til kraniet. Her beskriver vi detaljeret den kirurgiske procedure, fra subdural implantation af begge halvkugler til genopretning af dyret. Vi fokuserer på den auditive cortex som et eksempel på målområde, hvor fremkaldte potentialer induceres af akustisk stimulering både under bedøvede og frit bevægelige forhold. På forskellige tidspunkter er dyrets hjerne afbildet i MR (eller CT for de kliniske elektroder) under anæstesi, og elektrodernes elektrokemiske egenskaber måles. Elektrodekarakteriseringsmetoder bruges til at følge udviklingen af implantatet og elektrodevævsgrænsefladen (se Schiavone et ^al.19 for flere detaljer). Disse inkluderer kronoamperometri for at undersøge stimuleringsevnen for elektrodekontakten, elektrokemisk impedansspektroskopi (EIS), der kan indikere udviklingen af elektrodens resistive og kapacitive komponenter, og interkanalmodstandsmålinger for at sonde for hermetiske indkapslingsfejl. Endelig har vi udviklet en vævsekstraktionsrørledning til at perfusere hjernen efter eutanasi, eksplant den med elektroderne på plads, sektionere den og udføre histologisk analyse ved hjælp af forskellige inflammationsmarkører. Samlet set vil denne metode muliggøre prækliniske studier med robust multimodal dataindsamling til fremtidig klinisk oversættelse af nye teknologier og terapier på hjernen.

Protocol

Kirurgiske og adfærdsmæssige procedurer blev godkendt af den lokale etiske komité i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og godkendt af lokale (kanton Genève) og føderale (schweiziske) veterinærmyndigheder med autorisationsnummer GE11120A. Hun-minigrise af Göttingen (n = 7) i alderen 2-6 måneder (5-8 kg) blev anvendt i dette studie. 1. Prækirurgisk planlægning In vitro karakterisering af det bløde implantatsystemKronoamperometri: Optag spændingsfaldet ved injektion af en bifasisk strømpulsudvikling (dvs. spændingstransienten [VT]) ved hjælp af et oscilloskop forbundet parallelt med en pulsgenerator. Tilslut pulsgeneratoren sekventielt til hver elektrode og en platintæller i saltopløsning (fosfatbufret saltvand [PBS] 1x). Se trin 3.1 for indstillingerne. Elektrokemisk impedansspektrogram: Mål den elektrokemiske impedans ved forskellige frekvenser ved hjælp af et potentiometer. Tilslut potentiometeret sekventielt til hver elektrode ved hjælp af platintælleren og en Ag/AgCl-referenceelektrode i saltopløsning (PBS 1x). Se trin 3.2 for indstillingerne. Interkanalmodstand: I tør tilstand måles jævnstrømsmodstanden (DC) mellem tilstødende kanaler ved hjælp af et håndholdt multimeter. Valg af implantat: Efter de tre ovennævnte målinger skal du vælge implantatet sammen med følgende kriterier: impedans ved 1 kHz under 100 kΩ og ingen modstand mellem kanalerne under 1 MΩ. SteriliseringImplantatsterilisering: Placer de valgte implantater individuelt i steriliseringsposer sammen med en steriliseringsmarkør og forsegl dem. Brug dobbelt emballage for at sikre sterilitet under operationen.BEMÆRK: I dette tilfælde anvendes hydrogenperoxid (H2O2) gassterilisering på grund af den korte tidscyklus og lave temperatur (55 °C). Alternativer er ethylenoxid (ETO) gas eller autoklavsterilisering, men kompatibilitet med implantatsystemet bør sikres. Instrumentsterilisering: Placer de rensede instrumenter i dobbelte steriliseringsposer eller sterile instrumentkasser sammen med steriliseringsmarkører. Autoklavesterilisering er mest almindelig for instrumenter, menH2O2eller ETO er mulige alternativer. 2. Kirurgisk implantation af bløde ECoG-arrays AnæstesiPræmedicinering: Isoler dyret og fastgør det natten over. Injicer en blanding af midazolam ved 0,75 mg/kg, atropin ved 0,25 μg/kg og haldol ved 0,1 mg/kg intradermalt, og vent, indtil dyret er bedøvet. Væg dyret, før du fortsætter. Installation af intravenøs (IV) bly:Placer dyret på operationsbordet på en varmepude. Fremkald anæstesi ved at placere en ansigtsmaske på dyret ved hjælp af sevofluran ved 3% -3,5%. Placer elektrokardiogramledninger på maven, en blodmætningssensor på halen og en temperatursensor i næseboret. Placer en IV-ledning på en ørevene og bekræft blodadgang ved hjælp af en sprøjte fyldt med saltvand. Sørg for, at øjnene holdes hydreret ved hjælp af salve. Intubation: Injicer en bolus af atracurium ved 0,5 mg / kg, ketamin ved 1 mg / kg og fentanyl ved 1-2 μg / kg. Placer dyret på ryggen til intubation. Indsæt et 4,5 mm rør. Medicin: Efter intubation skal du stoppe sevofluranbedøvelsen og installere en propofolinfusion ved 10 mg / kg / time, fentanyl ved 2 μg / kg / time, atracurium ved 0,2-0,5 mg / kg / time og saltvand ved 4-7 mg / kg / time. Start en infusion af mannitol ved 1 g / kg / t for at reducere hjerne hævelse under operationen.BEMÆRK: Der kan anvendes et multimodalt analgesiregime, hvis det anbefales af den lokale dyreetiske komité. Præoperativ røntgenPlacer dyret på maven i sfinxpositionen. Fjern midlertidigt metalgenstande i nærheden af dyrets hjerne og kranium (f.eks. temperaturbly i næseboret). Få en aksial og sagittal plan røntgenstråle med en kontrast af knoglen. Placer en metallisk genstand med kendte dimensioner i sagittaloptagelsesfeltet for at tjene som en skala til måling af kranietykkelsen foran og bag på hjernen. Identificer placeringen af de frontale bihuler (synlig ved hulrum under kraniet) og markér den bageste placering på dyrets hoved ved hjælp af en permanent markør. Dette vil indikere det fjerneste punkt, hvor enhver kraniotomi eller skrueplacering kan udføres i den kirurgiske tilgang, der er beskrevet nedenfor. Aseptisk felt og hudforberedelse: Barber hele overfladen af hovedet ud over det kirurgiske felt. Brug en steril pude til at skrubbe hovedet grundigt med betadin. Placer derefter sterile gardiner på instrumentbordet og på dyret for kun at afsløre det kirurgiske vindue. Til sidst skrubbe hovedet igen med en steril pude ved hjælp af betadin. Kraniotomi og durotomiHudskæring: Skær huden med en skalpelkniv langs midterlinjen. Musklen og periosteum (25 mm lateralt fra bregma på begge sider og 40 mm forreste og bageste til bregma) adskilles fra knoglen ved hjælp af en hindbær, og placer sprederne for at få optimal adgang til senere boring. Mål og mærkning: Identificer bregma og lambda, og markér dem med en steril kirurgisk pen (figur 2A, B). Brug en steril lineal til at definere knogleklappens kontur centreret omkring implantationsmålet på begge halvkugler. I dette specifikke tilfælde blev den auditive cortex valgt med koordinater -5 mm til -15 mm fra bregma og -4 mm til -20 mm lateralt. Juster derefter kraniotomien til implantatets størrelse og anatomiske vartegn, hvilket begrænser åbningsstørrelsen. Kraniotomi:Brug en knoglebor med en rund skærekrone til at bore konturen af kraniotomien under hensyntagen til tykkelsen af kraniet målt i trin 2.2. Skyl borestedet med saltopløsning for at undgå overophedning af knoglen. Bor forsigtigt omridset homogent, indtil du når dura mater. Ved det første gennembrud skal du afslutte boringen af omridset, indtil det er tyndet nok til næsten at bryde igennem. Brug derefter en flad spatel (enten på midterlinjen eller sidesiden) til at bryde knogleklappen væk i ét stykke ved hjælp af kraniotomikanten som gearing. Hvis der opstår for meget modstand, skal du fortsætte med at tynde knoglen. Placer knoglestykket i sterilt saltvand. Når knogleklappen er fjernet, skal du forsigtigt skære kanten af kraniotomien væk ved hjælp af en Kerison for at undgå, at den skarpe knoglekant skærer ind i dura mater. Hvis der opstår overdreven blødning på dura mater eller knoglen, skal du bruge henholdsvis gelfoam eller knoglevoks. Anbring en våd komprimering (standardpude i steril saltopløsning) i kraniotomien og gentag dette trin på den anden halvkugle (figur 2B). Durotomi:Brug nålen fra et 6-0 sutursæt til forsigtigt at gennembore og løfte dura mater i den forreste eller bageste ende af kraniotomien halvvejs mellem den mediale og laterale side og skabe begyndelsen på et snit med stikkniven. Brug derefter en lille flad spatel indsat i det subdurale rum, der fungerer som en skærebase for at beskytte cortex, til at skabe en anteroposterior slids i dura mater ved at gå frem samtidig med begge værktøjer. Sørg for, at slidsen er lidt større end implantatets bredde (figur 2C). Hvis der opstår blødning eller skade på dette trin, skal du dække det med gelskum og vente, indtil det stopper.BEMÆRK: Spaltebanen bør tilpasses, hvis der er store blodkar til stede i dura mater for at undgå blødning. ImplantationIndsættelse af enhed:Skyl implantatet (supplerende figur 1A) med saltvand på begge sider, så det lettere glider ind i det subdurale rum. Placer implantatet over dura mater-slidsen, og indsæt enheden subduralt med små pincet ved at skubbe den sekventielt på hver kant. Hold forsigtigt piedestalenden af enheden og gå videre med implantatet for ikke at skabe spændinger, der forhindrer indsættelsen. Når forbindelseskanten er placeret oven på slidsen, skal du stoppe indsætningen. Fastgør implantatet: For at fastgøre implantatet på plads skal du placere en titaniumbro over kablet efter kanten af kraniotomien eller i forankringsvingerne og fastgøre det med en eller to titaniumskruer ved hjælp af den passende skruetrækker (figur 2D). Jordplacering: Fjern forsigtigt 1 cm af jordledningernes isolering og indsæt den epiduralt i den bageste ende af kraniotomien (eller et hvilket som helst epiduralsted langt fra cortex af interesse eller store blodkar) (ledning i figur 2E) Gentag trin 2.4.4. og 2.5.1.-2.5.3 på den kontralaterale halvkugle. Intraoperativ røntgen for at bekræfte placering:Placer en våd pude (standardpude i steril saltopløsning) over operationsstedet for at holde vævet hydreret. Derefter placeres en steril kirurgi drapering for at dække dyrets hoved. Tag plane røntgenbilleder (aksiale og sagittale) for at sikre, at implantaterne er godt placeret og ikke foldes ved hjælp af røntgenmarkørerne som indikatorer. Hvis ikke, skal du fjerne gardinet og udfolde anordningen for at indsætte det igen (følg trin 2.4.4 og 2.5.1.-2.5.3 igen). Dura mater lukning: Sutur dura mater forsigtigt rundt om implantatkablet ved hjælp af en 3-0 resorberbar sutur og en lille nåleholder. Bring de to dura mater-kanter sammen så meget som muligt uden at rive gennem den tynde membran med suturtråden (figur 2D, E). Placering af knogleklap: Fastgør en titaniumbro på den forreste og bageste del af hver knogleklap ved hjælp af en titaniumskrue. Vær omhyggelig med at planlægge placeringen af Ti-broerne i forhold til placeringen af fodpladebenene i de næste trin. Skru enden af titaniumbroerne til kraniet (figur 2F, G). Piedestal og fodplade placeringPlacering: I denne konfiguration har fodpladen seks ben med to skruehuller hver (supplerende figur 1B). Planlæg placeringen af fodpladen på kraniet for at optimere skruernes placering (undgå at placere dem ved kanten af kraniotomien eller i temporalmusklen). Spring hullerne i benene over, hvis de ikke kan skrues fast. Fodpladesikring: Skru fodpladens titanskruer i, indtil den sidder godt fast (se figur 2H). Piedestalplacering: Fjern titaniumbroerne over forbindelseskablerne, og vend piedestalen for at lande på fodpladen. Skru soklen på fodpladen. Kontroller, at soklen sidder godt fast (figur 2I). Sutur og lukningRengøring af såret: Rens det subkutane rum for knogle eller andet snavs ved at skylle med saltvand. Skær lidt hud væk omkring piedestalkanterne for at skabe en rund kant efter cylinderen. Subkutane suturer: Fjern sprederne og fold hudflapperne sammen. Opret subkutane suturer med en 4-0 ikke-resorberbar suturtråd, 3 mm fra hinanden ved hjælp af enkle afbrudte suturer eller enkle kontinuerlige suturer. Start væk fra piedestalen, bevæg dig mod den på begge sider af snittet. Dermale suturer: Sutur huden ved hjælp af en 6-0 ikke-resorberbar suturtråd med suturer 5 mm fra hinanden. Start væk fra piedestalen, bevæg dig mod den på begge sider af snittet. Sørg for at opnå god vævsapposition mellem de to hudflapper og nær piedestalkanten for at undgå et tomrum (figur 2J). Sårbandage: Rens sårområdet igen med en steril pude og betadin. Påfør en selvklæbende steril bandage over såret. In vivo-målinger: For in vivo-målinger skal du følge afsnit 3, 4 og 5. Opvågning: Når alle målinger er udført, skal du fjerne dyret fra alle bedøvelsesmidler, men holde det under ventilation. Ved analgesi påføres et buprenorphinplaster (25 mg/time) i 24 timer. Placer dyret på en varmepude dækket med gardiner for at fremskynde vækningstiden. Når spontan vejrtrækning er genoprettet, ekstuberes dyret og anbringes under en iltmaske, indtil bevidstheden er genoprettet (hvilket kan tage 1 til 4 timer). Postoperativ dyrepleje: Hold dyret under nøje overvågning i 5 dage. Giv en dosis cephalexin på 75 mg to gange dagligt med mad, adskilt fra andre dyr. Udfør desinfektion af såret dagligt ved at anvende rigelige mængder betadin med gennemblødte sterile puder (bedst udført under fodring).BEMÆRK: Langtidspleje og opstaldning: Det opererede dyr holdes isoleret i 24 timer. Det sættes tilbage i sin oprindelige sociale gruppe, hvis dyret er godt nok til at interagere socialt med sine jævnaldrende. Daglig observation af piedestalen og hudåbningen skal udføres for at følge integrationen af enheden på hovedet. Når det er relevant, skal du rengøre placeringen omkring piedestalen med rigelige mængder betadin. 3. In vivo-karakterisering af det bløde implantat Kronoamperometri: Optag spændingsfaldet ved injektion af en bifasisk strømpulsudvikling (dvs. VT) ved hjælp af et oscilloskop forbundet parallelt med en pulsgenerator. Tilslut pulsgeneratoren sekventielt til hver elektrode og jordledningen. Udfør stimuleringspulsen ved 100 μA med en pulsbredde på 300 μs ved 100 Hz. Elektrokemisk impedansspektroskopi: Mål den elektrokemiske impedans ved forskellige frekvenser ved hjælp af et potentiometer. Tilslut pulsgeneratoren sekventielt til hver elektrode ved hjælp af jordledningen som både modelektrode og jord. Indstil excitationsspændingen til 200 mV og frekvensområdet fra 1 Hz til 1 MHz med tre punkter pr. Årti. Korte målinger mellem kanaler: Mål DC-modstanden mellem tilstødende kanaler ved hjælp af et håndholdt multimeter. In vivo måles interkanalens DC-resistens kun for at verificere, at der ikke forekommer mangel under 1 kΩ, hvilket indikerer total indkapslingsfejl. 4. Elektrofysiologisk registrering Spontan aktivitet: Tilslut det trådløse optagesystem gennem piedestalen, og registrer baselineaktiviteten i 2-3 minutter. Disse optagelser vil tjene som en kontrol til at analysere de auditive fremkaldte potentialer. Auditive fremkaldte potentialer: Ud over det trådløse system skal du indsætte højttalere i et lukket felt i dyreørerne. Afspil tone burst akustisk stimulering ved forskellige frekvenser (fra 200-20.000 Hz) ved omkring 70 dB lydtrykniveau (SPL) over 120 gentagelser. Gennemsnit derefter optagelserne og juster dem over stimulusperioden til analyse. Sensoriske fremkaldte potentialer: Placer nålene i trynen i tre forskellige positioner. Fremkald sensoriske potentialer ved at stimulere snuden i ~ 30 s med pulsgeneratoren ved forskellige amplituder for at opnå rekrutteringskurverne. 5. In vivo-billeddannelse Dyretransport: Hold dyret under propofolanæstesi som beskrevet i trin 2.1. Brug en transportvogn, der huser en ventilator, sprøjtepumpe og vitale skiltemonitorer til at transportere dyret fra operationsrummet til billedbehandlingsfaciliteterne og tilbage. Computertomografi røntgenscanning: Placer dyret på scannerbordet, og fjern eventuelle metalgenstande omkring hovedet (f.eks. temperatursensoren). Få en CT-scanning ved den mindste opløsning (0,4 mm skivetykkelse) ved hjælp af isometrisk erhvervelse med automatisk strøm- og spændingsvalg for knoglekontrast. Magnetisk resonansbilleddannelse: Fjern alt udstyr, der indeholder metal, fra dyret (brug MR-kompatible IV-ledninger og intubationsrør). Hold dyret ventileret og bedøvet under sevofluran ved 3% -3,5% ved hjælp af en ventilator placeret uden for MR-kammeret og forbundet gennem et langt rør til dyret. Før den første sekvens injiceres en bolus fentanyl ved 1-2 μg/kg. Brug tre isometriske sekvenser med den mindste opløsning: T1-, T2- og turbo spin echo (TSE)-vægtede sekvenser (parametre vist i supplerende fil 1). 6. Frit bevægelig optagelse Følg samme procedure som beskrevet i punkt 4 til optagelse af vågne signaler fra hjernen. Tilslut det trådløse hovedkulde ved enten at holde dyret i eksperimentatorens arme eller fodre dyret med godbidder for at distrahere det. Sørg for akustisk stimulering ved hjælp af eksterne højttalere placeret tæt på dyret. 7. Perfusion og vævsforberedelse VALGFRIT: Hvis dyret ikke allerede er under anæstesi, skal du følge trin 2.1 for anæstesiprotokollen. Indsættelse af et kateter i halspulsåren til perfusion (supplerende figur 2)Carotidarterie og jugular venedissektion: Skær halsen ved midterlinjen ved hjælp af en cauterizer/cutter. Skær først huden og derefter musklen efter den midterste hvide linje (ingen kar nedenunder) (supplerende figur 2A). Åbn yderligere ved hjælp af fingrene for at skabe plads omkring luftrøret og under musklen. Se efter halspulsåren (slå og lyserød); Vagusnerven er undertiden også omkring (hvid), og jugularvenen kan være under eller på siden (rød). Sprederne anbringes (se supplerende figur 2B). Start dissektionen af halspulsåren ved hjælp af fine tang og rund saks. Brug saks til at åbne konjunktivvæv. Hvis der ikke er blodkar, skal du skære; hvis der er blodkar, cauterize og gå fremad (supplerende figur 2C, D). Når den er dissekeret nok, skal du bruge en klemme til at gå under halspulsåren, så den er helt isoleret (supplerende figur 2E). Gentag den samme operation med halsvenen (supplerende figur 2F). Når begge fartøjer er fuldt dissekeret og isoleret, skal du placere suturtråd omkring dem. Luk dem ikke endnu. To suturer omkring halspulsåren, en helt i bunden (sutur 1-hjerteside til hjerneperfusion) og en på den anden side (sutur 2), er vist i supplerende figur 2G. Placer en sutur omkring halsvenen (sutur 3), ikke lukket; Marker ledningerne med tape til sektionering af venen senere. Luk sutur 1 meget fast, ellers bløder den (supplerende figur 2H). Bind tre knob. Placer en klemme på ledningen for at lægge vægt og skabe spændinger i halspulsåren. Klem halspulsåren ved hjælp af en karklemme på den modsatte side af halspulsårens dissektion (hjerneside til hjerneperfusion; Supplerende figur 2I). Sutur 2 er i midten, ikke lukket endnu. Brug sorte tang til at fange og trække halspulsåren. Brug en finsaks, snit halvdelen af halspulsåren nær bunden af dissektionen (nær sutur 1, hjertesiden; se supplerende figur 2J). Sørg for, at sektionen er så pæn som muligt og når selve fartøjet, ikke kun “kappen”; Ellers vil kateteret ikke gå igennem. Kateteret indsættes som vist i supplerende figur 2K. Skyl og fyld kateteret, først med PBS, så der ikke er luft tilbage i kateteret (supplerende figur 2K-indsats ). Luk sutur 2 fast nok, så den ikke forsvinder, men ikke for meget, så kateteret stadig kan bevæge sig lidt (supplerende figur 2L). Fjern derefter beholderklemmen, afslut indsættelsen af kateteret så langt som muligt, og afslut lukningen af sutur 2 (luk fast). Hvis det ønskes, skal du bruge suturtråde ved sutur 1 til at fastgøre kateterets bund til huden ved udgangen af såret som et ekstra sikkerhedstrin. Overfør derefter dyret til perfusionszonen og sæt det i PBS / heparin. Når perfusionen starter, skal du trække sutur 3 og skære jugularvenen Eutanasi: Giv pentobarbital (90 mg / kg) intravenøst og skyl linjen med saltvand for at sikre, at den fulde dosis administreres med succes. Perfusion: Ved hjælp af en perfusionspumpe (200 ml/min) sættes halskateteret i PBS/heparin (1 liter for en 15 kg gris) og derefter i PBS indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA) (5 l for et svin på 15 kg). Når perfusionen starter, træk sutur 3 og skær jugularvenen. Opsamling af vævHalshugning: Når perfusionen er overstået, løsnes dyrets hoved fra kroppen ved hjælp af en skalpel ved at skære gennem huden og musklen og indsætte bladet mellem den første og anden ryghvirvel. Postfiksering: Dyk hovedet ned i 4% PFA i PBS i yderligere 48 timer ved 4 °C og overfør derefter til PBS før hjerneekstraktion. Hjerne- og implantatekstraktion:Fjern huden ved hjælp af en skalpel og begynd at skære knoglen omhyggeligt ved hjælp af en rongeur startende fra de første hvirvler, efter rygmarven til lillehjernen. Når lillehjernen er udsat, skal du forsigtigt fjerne de tidlige knogler og udsætte parietal og frontal lobes. På dette tidspunkt skrues piedestalen af fodpladen og skærer fodpladens fødder med en tang. Fjern knoglen nær kabelindgangen i kraniet for at frigøre implantatsystemet fra knoglen uden at trække implantaterne ud af dura mater-udgangen. Hvis implantatkablerne er indlejret i knoglen, skal du klippe kablet så tæt som muligt på udgangen. Når nok hjerneoverflade er udsat, skal du forsigtigt klippe dura efter midterlinjen ved hjælp af en lille saks. Frigør implantatkablerne fra dura mater-udgangen. Tag billeder fra implantatets placering på hjernen. Brug derefter en lille ske til at løsne hjernen fra kraniale nerver nedenfor. Udtræk forsigtigt hjernen. Fjern implantaterne fra hjernen. Postfiksering af hjernen: Afhængigt af perfusionskvaliteten postfikser den ekstraherede hjerne igen i 24 timer i 4% PFA i PBS ved 4 °C. Opbevares i 0,1 M PBS ved 4 °C, indtil hjernen er skåret. Hjerneskæring: Adskil de to halvkugler ved hjælp af et barberblad. Skær derefter hjernen ortogonalt i fire forskellige stykker. Skær den implanterede zone i halve for at opnå to blokke indeholdende den implanterede zone og et kontrolområde. Gem de to andre blokke, hvis der er behov for flere kontroldias. Kryobeskyttelse og frysning af hjernen: Hjerneblokkene overføres til en opløsning af først 15% saccharose og derefter 30% saccharose ved 4 °C, indtil hjernen styrtdykker og når ligevægt. Derefter fryses vævet i isopentan ved -55 °C i et vævsfrysesystem. 8. Histologi VævssektioneringKryostat: Placer den frosne hjerne i en kryostat og trim, indtil hele sektioner er opnået. Skær derefter hjernen i 40 μm sektioner og nedsænk i grupper på tre i 0,1 M PBS i brøndplader. Bemærk omhyggeligt rækkefølgen af pladerne. Valg af sektion: Vælg sektionerne afhængigt af den zone, der skal analyseres (implanteret område eller kontrolzone). Tag sektionerne sekventielt ud af brøndpladerne ved hjælp af en fin børste til at inspicere dem for skader. Anbring dem i nye brøndplader fyldt med 0,1 M PBS til yderligere farvning. ImmunhistokemiForberedelse: Inkuber sektionerne i 0,3% Triton X/PBS i 15 minutter, efterfulgt af 3% bovint serumalbumin (BSA)/PBS i 1 time ved stuetemperatur (RT). Primære antistoffer: Inkuber vævene med primære antistoffer i 48 timer ved RT (anti-GFAP, rotte, fortyndet ved 1/300; anti Iba1, kanin, fortyndet ved 1:400; anti-NeuN, marsvin, fortyndet ved 1:1.000; alt i 1% BSA/PBS). Dæk brøndpladerne med aluminiumsfolie. Vask: Vask brøndene med 0,1 M PBS tre gange i 5 min. Sekundære antistoffer: Inkuber vævene med sekundære antistoffer i 2 timer ved RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; alle fortyndet ved 1:400 i 1% BSA / PBS). DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol): Inkuber vævene med DAPI i 15 minutter (1/1.000 i 1% BSA/PBS). Vask: Vask brøndene med 0,1 M PBS fem gange i 15 min. Montering: Monter lysbillederne ved hjælp af monteringsmedier og en dæksel. Opbevar lysbillederne i mørke i køleskab ved 4 °C. ImagingHele diasbilledet: Afbild diasbillederne ved 10x forstørrelse (objektiv arbejdsafstandsværdi = 3.100 μm) ved hjælp af et diasscannermikroskop ved tre forskellige bølgelængder (640 nm, 560 nm, 485 nm). Alle oplysninger om strøm og forstærkning findes i supplerende fil 2. Mikroskopisk billeddannelse: Billede interesseområdet ved 20x forstørrelse (apochromat 20x / 0.8 M27) ved hjælp af et konfokalmikroskop ved fire bølgelængder (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Alle oplysninger om strøm og forstærkning findes i supplerende fil 3.

Representative Results

For at bekræfte placeringen (figur 3A) og funktionaliteten af enhederne udføres elektrofysiologiske optagelser intraoperativt efter piedestalplacering. Baselinesignalet opnås først over 2 minutter uden stimuli som kontrol af basal aktivitet. For det andet stimuleres dyret akustisk med et toneudbrud ved forskellige frekvenser (500-20.000 Hz), og rådataene beregnes som gennemsnit over stimulusperioden for at kortlægge auditive fremkaldte potentialer på tværs af arrayet (f.eks. ved 800 Hz sammenlignet med baseline; Figur 3B). De data, der vises her, er ubehandlede, men hvis der er for meget støj, kan hak- og båndpasfiltre anvendes. Typiske støjkilder i det kirurgiske teater omfatter varmepuder, tilsluttede øvelser og suge- eller cauterizers (blandt andre), der skal fjernes inden erhvervelse. I vågne optagelser bør store muskelbevægelser omkring hovedet, såsom tygning, undgås for renere datasæt. Denne protokol blev anvendt på hvert optagelsestidspunkt, og signaler for en enkelt kanal kunne sammenlignes over tid. Et eksempel er illustreret i figur 3C, der viser responsens robusthed og udvikling. Registreringskapaciteten for hver kontakt i løbet af eksperimentets tidsforløb kan evalueres ved at beregne standardafvigelsen for basislinjesignalet på hvert tidspunkt (figur 3D). I denne undersøgelse faldt signal-støj-forholdet og afregnede mellem dag 0 og måned 6 på trods af en vis variation på grund af den begrænsede varighed af optagelsesperioden (dvs. 2 min). Dette kan yderligere korreleres med elektrodeimpedanser. In vivo-billeddannelsen udføres postoperativt for at vurdere hjernens tilstand og implantatpositionering. I den første iteration af protokollen blev der ikke udført nogen intraoperativ røntgenstråle, hvilket resulterede i en foldet enhed, som det er synligt i figur 4A på en T1-vægtet MR-sekvens (se desuden figur 4B). Der blev ikke observeret nogen adfærdsændring hos dyret, men over tid resulterede dette i en fibrotisk indkapsling omkring enheden på grund af den makroskopiske kompression af hjernen omkring implantatplaceringen (figur 4C). Efter denne oplevelse blev intraoperativ røntgen introduceret, som vist i figur 4D, hvor de radioaktive markører (sorte bjælker synlige på implantatet i indsat figur 4D) vises at være godt placeret. Hjernens overflade er derefter intakt, som det kan observeres i den postoperative MR i figur 4E. Samlet set er det med dette implantat og piedestalsystem muligt at billeddannelse i hele hjernen. Forskellige sekvenser i koronalplanerne gør det muligt at se anatomiske strukturer (figur 4F, G; T1 og T2 MR-sekvenser) eller tilstedeværelsen af væske og blod omkring implantatet (figur 4H; TSE-vægtet MR-sekvens). Piedestalsystemet skaber næsten ingen artefakter, bortset fra nogle små sorte kontrasthulrum omkring titanskruerne (se figur 4G). Derudover anvendes kliniske elektroder som komparatorer i denne undersøgelse, men kan ikke afbildes i MR på grund af opvarmnings- og sikkerhedsproblemer. Derfor erhverves CT-scanninger på disse dyr, som vist i figur 4I. Elektroderne er tydeligt synlige, og piedestalsystemet påvirker ikke billedkvaliteten. Efter implantationsperioden perfuseres dyret, og hjernen ekstraheres. I denne undersøgelse udføres analysen af det inflammatoriske respons uafhængigt på hver halvkugle. At skære hjernen i halve er lettere til vævsforberedelse før sektionering og har den fordel, at sektioner kan monteres på standard mikroskopi-dias. Et eksempel på en hjerneprøve er vist før (figur 5A) og efter (figur 5B) skæring i blokke. Omridset af implantatet er tydeligt synligt og har skabt en lille bule i hjernen. Ved at skære i parallelle planer er vævet allerede justeret til kryostaten, og sektioner kan let skæres uden vævstab til trimning (figur 5C). Efter farvning er hele vævssektionen afbildet (figur 5D), hvor for eksempel neuronlaget er tydeligt synligt i detaljer (se NeuN-markør). Hele sektioner er skrøbelige og kan undertiden føre til tab af væv (se bunden af figur 5D), men interesseområdet er intakt. Ved et nærmere syn, muliggjort af konfokal mikroskopibilleddannelse ved 40x, er cellerne klart defineret og muliggør f.eks. fin undersøgelse af inflammatoriske markører (figur 5E). Yderligere kvantificeringsanalyse kan udføres for at sammenligne betændelse mellem kontrol og implanterede halvkugler. Figur 6 viser den elektrokemiske karakterisering af de implanterede elektroder. In vitro elektrokemisk impedansspektroskopi af det bløde elektrodearray med impedansmodul og fase er vist i figur 6A, og impedansmodulet ved 1 kHz over 6 måneders implantation er vist i figur 6B. Figur 1: Skematisk oversigt over eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Minimalt invasiv implantation af blød ECoG på hjernen . (A) Kirurgisk adgang til kraniet med angivelse af bregma. (B) Bilateral kraniotomi med synlig dura mater. (C) Spalte durotomi på den første halvkugle. D) Subdural implantation af blød ECoG og dura mater lukning. (E) Spalte durotomi på den anden halvkugle. Benklapfiksering på den første halvkugle ved hjælp af titaniumbroer. F) Implantation af blød ECoG på den anden halvkugle og lukning af dura mater. (G) Benklapfiksering på den anden halvkugle. (H) Fodpladeplacering på kraniet. I) Piedestal fiksering på fodpladen. (J) Lukning af huden omkring piedestalbasen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Registrering af auditive fremkaldte potentialer . (A) Skematisk af elektrodeplacering på overfladen af temporallappen. (B) Repræsentativ kortlægning af baselineaktivitet (grå spor) og auditive fremkaldte potentialer som reaktion på en 800 Hz tone burst-stimulering (lilla spor). Hvert gennemsnit svarer til en kanal på det bløde ECoG-array. Gennemsnittet udløses på det analoge indgangssignal fra lydstimuleringen. “ON” og “OFF” akustiske stimuleringsperioder er noteret på en kanal nederst til venstre. (C) Udvikling over tid (dag 0, måned 2 og måned 5) af en enkelt kanalrespons efter akustisk stimulus sammenlignet med baselinesignal, når der ikke præsenteres stimulus (grå). Gennemsnittet udløses på det analoge indgangssignal fra lydstimuleringen. “ON” og “OFF” stimuleringsperioderne er noteret nederst. Det fremkaldte potentiale i “ON” -stimuleringen er markeret med pile. (D) Standardafvigelse pr. kanal (farvede prikker) pr. tidspunkt for basislinjeregistreringen. Medianværdier er repræsenteret med fed blå. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: In vivo-billeddannelse af hjernen og implanterede elektroder . (A) Postoperativ T1-vægtet MR i koronalplanet. En pil angiver et foldet implantat. (B) Forstørret del af A, hvor foldningen af implantatet skaber en bule i hjernen. (C) T1-vægtet MR ved 1 måneds implantation, der viser kompression af hjernen på grund af den fibrotiske indkapsling af hjernen på samme sted som C. D) Røntgen af det intraoperative plan, der verificerer implantatets placering og ingen foldning, som observeret ved placeringen af den radioaktive markør. Indsat: Fotografi af implantat med radioaktiv markør synlig. (E) Postoperativ T1-vægtet MR i koronalplanet med optimal implantatplacering. F) T1-vægtet MR ved implantation ved 1 måned. (G) T2-vægtet MR ved 1 måneds implantation. En pil viser billeddannelsesartefakten fra titaniumskruerne, der holder fodpladen på plads på kraniet. H) TSE-vægtet MR-scanning efter implantation efter 1 måned. I) CT-scanning af dyret implanteret med de kliniske elektroder. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Histologianalyse af hjernen efter langvarig implantation. (A) Fotografi af en udplantet og perfuseret hjerne-venstre halvkugle. (B) Perfuseret hjerne skåret i blokke før frysetrinnet. (C) Billede af opsætning af hele bloksektioner på kryostaten; Hele “forskårne blokke” kan sektioneres. (D) Immunfarvningsbilleddannelse af hele halvkuglen (diasscanner, 20x objektiv) og (E) zoom på de første lag af cortex (konfokal billeddannelse, 40x objektiv), der viser gliaceller, astrocytter og neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Elektrokemisk karakterisering af de implanterede elektroder. (A) In vitro elektrokemisk impedansspektroskopi af det bløde elektrodearray (små grå linjer for hver kanal, gennemsnittet i rødt) med impedansmodul (øverst) og fase (nederst). (B) Udvikling af impedansmodulet ved 1 kHz over 6 måneders implantation (gennemsnit i blåt; grå linjer er de individuelle kanaler; in vitro-målingen er angivet som reference i rødt). Klik her for at se en større version af denne figur. Supplerende figur 1: MR-kompatibel piedestal. (A) Kronisk MR-kompatibelt transdermalt forbindelsessystem (piedestal) for at få adgang til det bløde elektrodearray. B) Sokkel med elektroder monteret på fodpladen til forankring af kraniet. Indsat: Oplysninger om fodpladen. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende figur 2: Kirurgisk adgang for optimal perfusion af hjernen. (A) Hudskæring og adgang til placeringen af halspulsåren og halsvenen. (B) Dissektion af vævet omkring blodkarrene. (C,D) Identifikation og dissektion af vævet omkring halspulsåren og halsvenen. (E) Isolering af halspulsåren fra vævet nedenunder. (F) Isolering af halsvenen fra vævet nedenunder. (G) Suturtrådsplacering omkring halspulsåren (sutur 1 og sutur 2) og halsvenen (sutur 3). (H) Lukning af sutur 3 i bunden af halspulsåren (hjertesiden) for at undgå blødning under åbning af karret. (I) Fastspænding af halspulsåren på den modsatte side af H. (J) Sektionering af halspulsåren. (K) Indsat kateter i åbningen fra J. Indsat: Grundet kateter med saltvand skyllet fra en sprøjte til kateterspidsen. (L) Lukning af sutur 2 for at holde kateteret på plads og langs arterien. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende fil 1: Parametre for henholdsvis T1- (side 1-2), T2- (side (3-4) og TSE-vægtede (side 5-6) MR-sekvenser. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende fil 2: Metadata for diasscanner til heldiasbilleddannelse af farvede hjerneskiver. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende fil 3: Metadata til konfokal billeddannelse af forstørret sektion af farvede hjerneskiver. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Vi rapporterer her en metode til langsigtet implantation og evaluering af bløde ECoG-arrays. I denne undersøgelse har vi designet en konsekvent, minimalt invasiv kirurgisk tilgang til bilateral implantation af funktionelle elektrodegitter over tindingelapperne (her rettet mod den auditive cortex). Vi evaluerede først gitterets funktionalitet ved med succes at registrere fremkaldte potentialer i løbet af undersøgelsen (6 måneder) og spore elektrodernes elektrokemiske egenskaber (se figur 6). For det andet vurderede vi biosikkerheden i nettene, in vivo ved hjælp af MR og etablering af et fuldt MR-kompatibelt system og post mortem ved at designe en protokol for vævsindsamling og immunfarvning.

For at minimere invasivitet optimerede vi størrelsen på kraniotomivinduet. For at nå den auditive cortex placeret på temporallappen og for at undgå resektering af den tidlige muskel, har vi udviklet en teknik til at glide implantatet under duraen. Denne teknik gør det muligt drastisk at reducere overfladen af den udsatte hjerne og stadig nå langt væk mål. Selvom denne type implantation kan virke blind, muliggør implementeringen af radioaktive markører på de enheder, der visualiseres i den intraoperative plan røntgenstråle, verifikation af positionering og sikrer, at arrayet ikke foldes under dura mater. Den subdurale glidning har vist sig at være sikker i de fleste af de gentagelser, vi har udført. Derudover minimerer durotomi i en spaltetilgang hjerneudbulning i den tid, kraniotomien er åben og letter lukningen omkring implantatet uden at kræve yderligere materiale såsom kunstig dura mater, hvilket kan bias det inflammatoriske respons. Endelig er styrken ved denne kirurgiske tilgang dens evne til at blive transponeret til forskellige kortikale regioner. Leg med koordinater, kraniotomipositionen og enhedens størrelse, som alle kan justeres, gør det muligt for denne metode at målrette mod det meste af cortexområdet.

Den kirurgiske metode, der præsenteres her, sammen med funktionel vurdering og undersøgelse af biointegrationen over tid, er ikke begrænset til den bløde elektrodeteknologi, der anvendes i denne rapport. Andre subdurale elektroder, der udvikles til menneskelig oversættelse, kan evalueres med samme protokol. Styrken ved denne metode er afhængig af det faktum, at de fleste stykker, såsom kablet og piedestalen, er modulære, personlige og kan tilpasses den specifikke enhed, der testes. Derudover kan intrakortikale eller dybe penetrerende sonder også anvendes i stedet for eller i kombination med de subdurale elektroder, da dette kun kræver justering af kraniotomi og durotomigeometri. De langsigtede resultater kan derefter sammenlignes med deres kliniske modstykker, som vi har gjort her.

En af de største begrænsninger ved den præsenterede metode er tilstedeværelsen af kraniet bihuler i minigrise, som udvikler sig i løbet af det første år¹². I denne henseende er det vigtigt at tage hensyn til implantationsalderen og dyrets størrelse. Udførelse af kraniotomier i det voksne kranium bryder bihulernes integritet og fører til en høj risiko for større infektion i kroniske omgivelser. Sådanne bihuler er synlige i planet røntgen og CT-scanning præoperativt. På den anden side er det heller ikke optimalt at udføre kronisk implantation for tidligt i et dyr, der er for lille, når kraniet gennemgår massiv vækst og ombygning. Vi antog, at disse “kraniebevægelser” efter operationen kunne få implantatet til at bevæge sig og folde, hvilket i sidste ende er skadeligt for eksperimentet. Vi har her fundet ud af, at Göttingen minipigs, cirka 5-6 måneder gamle (og 8 kg) på implantationstidspunktet, skal give de bedste resultater.

Til evaluering af ydeevnen af den implanterede ECoG til elektrofysiologiske optagelser har vi oprettet en hurtig protokol til auditiv fremkaldt potentiale (AEP) optagelse, der kan bruges i frit bevægelige dyr og under sedation. Det består i at præsentere en række akustiske toneudbrud ved bestemte frekvenser i løbet af få minutter. Fordelen ved en sådan protokol er, at den kan indstilles til den tilgængelige optagelseslængde ved at reducere antallet af undersøgte frekvenser. En udfordring ved registrering af kortikale signaler under anæstesi er, at dyrets bevidsthedsniveau skal tages i betragtning ved analyse og sammenligning af dataene.

Protokollen for perfusion blev justeret over tid ved observation af den ekstraherede hjernes kvalitet. Faktisk fandt vi det lettere at kateterisere halspulsåren kun og ikke halsvenen. Indledningsvis præsenterer litteraturen metoder, hvor jugularvenen kateteriseres for at dræne affald²⁰. Praktisk set begrænser dette strømmen ud af hjernen og fører til dårligere udvinding af blod og den samlede kvalitet af perfusion. Ved at skære jugularvenen og lade væsken undslippe i en stor beholder, hvor dyret ligger, øges effektiviteten af perfusionen.

Vi har udviklet en robust vævspræparationsmetode, der arbejder med antistoffer, der rutinemæssigt bruges til inflammationssporing. Vi har adskilt de to halvkugler af praktiske årsager, da halvdelen af grisens hjerne passer på standard mikroskopglas og dermed er kompatibel med det meste billedbehandlingsudstyr, der er tilgængeligt i histologilaboratorier. Ved at skære hjernen i blokke muliggøres direkte adgang til interessezonen uden at kræve yderligere skæring af hele hjernen eller trimning af store dele af vævet. Hjerneskiverne ved 40 μm kan samles i standard brøndplader og farves på en fritsvævende måde uden større protokolændringer fra andre arters immunfarvninger. Fuld hjerneimmunfarvning kunne også forestilles ved hjælp af for eksempel CLARITY-metoder²¹.

Samlet set er denne protokol, der dækker personligt implantatdesign til implantation, funktionsopfølgning og biosikkerhedsvurdering, robust og konsistent. Vi demonstrerede her dets gennemførlighed til at studere det auditive system, men det kan overføres til at teste andre fysiologiske funktioner. Desuden ligger styrken ved vores metode i, at den ikke er begrænset til minigrise, men fuldt ud kan overføres til andre arter som får, geder eller ikke-menneskelige primater. Til en vis grad kan det også let tilpasses rotter.

Materials

Bone drill	BBraun	Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit	BBraun	Neurocutter GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
Catheter	Venisystems	Abbocath 14G
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Insert speakers	Etymotic	Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter	Fluke	Fluke 1700
Oscilloscope	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator	AM Systems	Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage	Multichannel systems	W2100-HS32
Recording system	Multichannel systems	W2100
Screwdriver	Medtronic	Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488	Thermofischer	Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555	Thermofischer	Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647	Thermofischer	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Stab knife	Fine Science Tools	10316-14
Suture wire dermal	Ethicon	Vicryl 2-0
Suture wire dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0
Suture wire for catheter	Ethicon	Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura	Ethicon	Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous	Ethicon	Vicryl 4-0
Titanium bridge	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Cut out the required size
Titanium screws	Medtronic	9001635, 9001640
X-ray system	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm