ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo
Summary
מאמר זה מציג את המתודולוגיה להשגת והערכת הסתיידות כלי הדם על ידי בידוד אבי העורקים של מורין ואחריו חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מסוידות כדי לבחון את פוטנציאל המינרליזציה.
Abstract
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, והסתיידות כלי הדם היא המנבא המשמעותי ביותר לאירועים קרדיווסקולריים; עם זאת, אין כיום אפשרויות טיפול או טיפול להסתיידות כלי דם. ההסתיידות מתחילה בשלפוחיות חוץ-תאיות מיוחדות (EVs), המשמשות כמוקדי נוקלציה על ידי צבירת יוני סידן ופוספט. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשגה והערכה של הסתיידות באבי העורקים וניתוח כלי הרכב החשמליים שחולצו הקשורים. ראשית, דיסקציה גסה של העכבר מבוצעת כדי לאסוף איברים רלוונטיים, כגון הכליות, הכבד והריאות. לאחר מכן, אבי העורקים מבודד ונכרת מהשורש אבי העורקים לעורק הירך. לאחר מכן שניים עד שלושה אבי עורקים נאגרים ומודגרים בתמיסת עיכול לפני שהם עוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים. לאחר מכן, פוטנציאל המינרליזציה של כלי הרכב החשמליים נקבע באמצעות דגירה בתמיסת פוספט גבוהה ומדידת בליעת האור באורך גל של 340 ננומטר. לבסוף, הידרוג’לים של קולגן משמשים לצפייה בהיווצרות ובהבשלה של מינרלים מסוידים המיוצרים על ידי כלי רכב חשמליים במבחנה.
Introduction
הסתיידות היא המנבא המשמעותי ביותר לתמותה ותחלואה ממחלות לב וכלי דם1. הסתיידות משנה את מכניקת דופן העורקים עקב הצטברות מינרלים של סידן ופוספט2. בטרשת עורקים, הסתיידות עלולה להחמיר את הלחץ המקומי ולגרום לקרע פלאק, שהוא הגורם המוביל להתקפי לב. הסתיידות מדיאלית – הנובעת לעתים קרובות ממחלת כליות כרונית – נפוצה יותר ומובילה להתקשות עורקים משמעותית, תפקוד לקוי ועומס יתר לבבי 2,3. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפוליות לטיפול או מניעה של הסתיידות כלי הדם.
תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs) מאמצים פנוטיפ דמוי אוסטאובלסט ומשחררים שלפוחיות חוץ-תאיות מסתיידות (EVs) המעוררות מינרלים מתהווים, ובכך מניעות הסתיידות 4,5,6. תהליך זה דומה למינרליזציה פיזיולוגית של אוסטאובלסטים בעצם7. למרות שנקודת הסיום של מינרליזציה דומה בדופן כלי הדם ובמטריצת העצם, המנגנונים שבאמצעותם נוצרים כלי הרכב החשמליים המסוידים שונים בשתי הרקמות8. ישנם סוגים רבים של מודלים המשמשים לחקר הסתיידות כלי הדם. במבחנה, מודלים של תרביות תאים מחקים את המעבר האוסטאוגני של VSMCs והיווצרות מינרלים לאחר מכן עם מדיה מיוחדת.
כאשר לומדים הסתיידות in vivo, המודל המשמש תלוי בסוג ההסתיידות הנחקרת. מודלים של עכברים היפרליפידמיים משמשים לעתים קרובות לחקר הסתיידות טרשת עורקים, אשר נראית ממוקדת יותר בתוך רבדים עשירים בשומנים9. לעומת זאת, הסתיידות מדיאלית נפוצה יותר בכל כלי הדם ונחקרת לעתים קרובות באמצעות מודלים של מחלת כליות כרונית המשתמשים במשטר תזונה עשיר באדנין כדי לגרום לאי ספיקת כליות או טכניקות כירורגיות להסרת חלקים משמעותיים של הכליות10,11. מודלים אגרסיביים של הסתיידות כלי דם השתמשו בשילוב של מודלים של מחלת כליות היפרליפידמית וכרונית12. פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת הסתיידות כלי הדם באבי העורקים המוריני עבור הסתיידות מדיאלית וטרשת עורקים, חילוץ EVs מדופן אבי העורקים, וצפייה בפוטנציאל המינרליזציה ברכבים חשמליים המתקבלים ממודלים של תרביות תאים במבחנה. מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בפרוצדורות אלה בניתוחים מכניסטיים של הסתיידות כלי דם ולהעריך התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לציין את השלבים הקריטיים להשגת תוצאות מוצלחות. במהלך הבידוד של אבי העורקים murine, זה חיוני כי זילוח מבוצע כראוי. בעת הזרקת PBS, יש להקפיד לא לנקב את החדר הימני. זה יגרום לנוזל לדלוף ישירות מהחדר ולא לזרום דרך הריאות, מה שמשאיר דם בתוך אבי העורקים. לאחר שהזילוח בוצע כראו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01HL160740 ו- 5 T32GM132054-04) והקרן לחקר הלב של פלורידה. ברצוננו להודות לקסנדרה גומז על עזרתה בסינתזה ובהדמיה של ההידרוג’לים.
Materials
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. . Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
