Denne protokol beskriver en effektiv og billig metode, der bruger flydende medier til at vurdere virkningerne af kemiske toksiske stoffer på levedygtigheden af voksen Drosophila melanogaster.
Menneskelige industrier genererer hundredtusinder af kemikalier, hvoraf mange ikke er blevet tilstrækkeligt undersøgt for miljøsikkerhed eller virkninger på menneskers sundhed. Dette underskud af kemiske sikkerhedsoplysninger forværres af de nuværende testmetoder i pattedyr, der er dyre, arbejdskrævende og tidskrævende. For nylig har forskere og tilsynsmyndigheder arbejdet på at udvikle nye tilgangsmetoder (NAM’er) til kemisk sikkerhedstest, der er billigere, hurtigere og reducerer dyrs lidelse. En af de vigtigste NAM’er, der opstår, er brugen af hvirvelløse organismer som erstatning for pattedyrmodeller til belysning af konserverede kemiske virkningsmekanismer på tværs af fjernt beslægtede arter, herunder mennesker. For at fremme disse bestræbelser beskriver vi her en metode, der bruger bananfluen, Drosophila melanogaster, til at vurdere kemisk sikkerhed. Protokollen beskriver en enkel, hurtig og billig procedure til måling af levedygtighed og fodringsadfærd hos udsatte voksne fluer. Derudover kan protokollen let tilpasses til at generere prøver til genomiske og metabolomiske tilgange. Samlet set repræsenterer protokollen et vigtigt skridt fremad i etableringen af Drosophila som en standardmodel til brug i præcisionstoksikologi.
Mennesker udsættes konstant for kemikalier fra en række forskellige kilder, herunder luft1, mad2, vand3,4, medicin5, rengøringsmidler6, produkter til personlig pleje 7, industrielle kemikalier 7 og byggematerialer 7. Desuden indføres der tusindvis af nye kemikalier hvert år8, hvoraf mange ikke er ordentligt undersøgt med hensyn til sundhed og miljøsikkerhed. Denne mangel på tilstrækkelige kemiske sikkerhedstest skyldes til dels en overdreven afhængighed af pattedyrsmodeller såsom mus og rotter. Mens sådanne gnavermodeller er informative, er kemisk sikkerhedstest i disse systemer dyre, tidskrævende og forårsager ofte uacceptable niveauer af lidelse for forsøgsdyret9.
De økonomiske og etiske byrder, der er forbundet med sikkerhedstest af pattedyrs kemikalier, samt den tidskrævende karakter af undersøgelser af pattedyr er væsentlige medvirkende faktorer til manglen på data vedrørende nye kemikalier. For at løse dette problem gennemfører U.S. Environmental Protection Agency (EPA), Det Europæiske Kemikalieagentur (ECHA), Health Canada og andre agenturer foranstaltninger, der inkorporerer nye tilgangsmetoder (NAMs) i lovgivningsmæssige rammer10, hvilket placerer nordamerikansk og europæisk politik i overensstemmelse med internationale mål om at erstatte, reducere og forfine brugen af dyr (3R-princippet)11, 12,13,14. NAM’er omfatter en række assays primært baseret på in vitro– og in silico-modeller, der giver en mekanistisk forståelse af kemisk toksicitet i stedet for at observere modgang påført pattedyrs testarter, hvorved datagenereringshastigheden til kemisk risikovurdering øges, samtidig med at der stadig produceres high fidelity-output15. Det er imidlertid endnu ikke bevist, at disse metoder beskytter mod systemisk toksicitet, herunder forstyrrelse af vitale biologiske processer, der involverer interorgankommunikation og endokrin signalering. Desuden kan de ikke redegøre for bioakkumulering af kemikalier i specifikke væv, individuelle forbindelsers evne til at blive absorberet og udskilt og samspillet mellem adfærd og kemisk eksponering.
På grund af begrænsningerne ved in vitro- og beregningsmodeller bør en vellykket anvendelse af NAM’er til at reducere eller erstatte pattedyrsmodeller også omfatte hvirvelløse in vivo-modeller, såsom bananfluen, Drosophila melanogaster. Tidligere undersøgelser i fluen har vist, at denne organisme er velegnet til at studere de bevarede genetiske veje, der beskytter dyreceller mod giftige molekyler 16,17,18,19,20,21,22. Desuden viser fluen bemærkelsesværdig genetisk lighed med mennesker, herunder funktionelle homologer til over 65% af menneskelige sygdomme 23,24,25 og en endnu større bevarelse af vigtige funktionelle veje 26. Disse funktioner kombineret med deres relativt korte livscyklus, lave vedligeholdelsesomkostninger og let observerbare adfærdsmæssige reaktioner gør Drosophila velegnet til brug som toksikologisk model27,28,29,30. Desuden har fluer meget højere gennemstrømning end gnavermodeller og fanger effekter på stofskifte, fysiologi og hormonsignalering, der ikke let kan påvises af andre ikke-organismerNAM’er 9.
Protokollen beskrevet her repræsenterer en ramme for test af virkningerne af kemisk eksponering på voksen Drosophila. Metoden er designet til at være effektiv, billig og reproducerbar, samtidig med at den minimerer den tid, forskere skal være i kontakt med testkemikaliet og imødekomme prøveindsamling til metabolomics og andre omics-tilgange. Protokollen er optimeret til test af et enkelt kemikalie pr. eksperiment, men kan let rumme andre eksperimentelle parametre, såsom forskellige opløsningsmidler eller kombinationer af kemikalier.
Bananfluen Drosophila melanogaster fremstår som et kraftfuldt system til NAMs16,18,19,21. Ved at udnytte de uovertrufne genetiske ressourcer, der er tilgængelige for fluesamfundet, kombineret med de seneste fremskridt inden for genomik og metabolomics, er kemiske sikkerhedsundersøgelser ved hjælp af Drosophila i stand til hurtigt at identificere de molekylære mekanismer, hvormed individuelle forbindelser interfererer med metabolisme, fysiologi og cellesignalering (se for eksempel39). Denne billige protokol er designet til hurtigt at definere dosis-responskurver og efterfølgende generere prøver til RNA-seq og metabolomics-analyse. Desuden kan denne fleksible protokol tilpasses til brug med enhver genotype og kan rumme mange klasser af kemikalier.
Et bemærkelsesværdigt aspekt af denne protokol er valget af flydende fødevarer, der anvendes til kemisk eksponering, som er baseret på en tidligere undersøgelse, men adskiller sig fra de faste medier, der anvendes af de fleste toksikologiske undersøgelser af Drosophila18,22. Dette specifikke flydende medie blev valgt for at afspejle næringsindholdet i det standard, faste BDSC-medie, som fluerne også fodres med i denne protokol for at sikre, at fluerne får ensartet ernæring. Enkelheden af flydende fodringsmedier har mange fordele. Flydende medier er lettere at håndtere end fast mad, som enten skal smeltes og resolidificeres eller rekonstitueres fra pulver. Flydende medier øger også systemets gennemstrømning, sikrer jævn kemisk fordeling gennem fødemediet og reducerer den tid, der bruges på at arbejde med farlige forbindelser. Derudover kræver medierne ikke, at opløsninger opvarmes, hvilket letter testningen af flygtige testforbindelser. Endelig minimeres uønskede bivirkninger mellem testkemikaliet og andre kostkomponenter på grund af de relativt få komponenter, der indgår i fødevareopløsningen. Gæren, der anvendes i fødevaren, er også inaktiv, hvilket yderligere begrænser fodermediets reaktivitet. Bemærk dog, at metoden ikke er egnet til test af udviklings- eller larvetoksicitet.
Nogle af de materialer, der anvendes i protokollen, kan erstattes, såsom at bruge hætteglas med glasflue i stedet for polypropylen. De anvendte materialer blev imidlertid udvalgt til at være både inaktive og engangs for at undgå uønskede kemiske reaktioner mellem reagenser og kemiske eksponeringer, der kunne skyldes rengøring af glasvarer.
Brug af flydende fødevarer kræver et køretøj til levering af fødevarer. Celluloseacetatfiltrerpapir blev valgt til dette formål på grund af dets fleksibilitet og inaktive karakter28. Andre forskere brugte lignende protokoller, men med andre køretøjer, såsom sarte opgaveservietter eller glasfiberfilter29,30. Celluloseacetatfilterpapiret passede til disse behov, fordi det er et inaktivt køretøj, der kan skæres til den ideelle form, så det passer ind i bunden af hætteglassene uden store mellemrum mellem papiret og hætteglassets væg, hvilket forhindrer død som følge af, at fluer sidder fast i medierne eller selve køretøjet.
En vigtig begrænsning ved dette system er, at den maksimale testbare koncentration af et kemikalie er bundet til kemikaliets opløselighed. Ikke-vandopløselige forbindelser kræver et yderligere opløsningsmiddel, hvilket kan føre til yderligere eller synergistiske virkninger med kemikaliet af interesse. Dette kan også skabe situationer, hvor det ikke er muligt at fremstille stamopløsninger, der er koncentreret nok til at opnå det ønskede endepunkt i alle organismer, hvilket begrænser analysen af de resulterende data31. For at løse dette kan kemikalier med lav vandopløselighed testes ved at tilsætte op til 0,5% dimethylsulfoxid til fødevareopløsningen. Andre opløsningsmidler kan også anvendes, men yderligere forskning er nødvendig for hvert opløsningsmiddel af interesse for at bestemme den maksimalt acceptable opløsningsmiddelkoncentration i opløsningen for at maksimere opløseligheden og samtidig minimere opløsningsmiddelvirkninger på organismen.
Omfattende karakterisering af olfaktionsresponset i Drosophila har beskrevet, hvordan fluer undgår at indtage giftige forbindelser40,41, hvilket fører til reduceret fodring på behandlede medier. Det blå farvestofassay adresserer dette fænomen ved at give forskere mulighed for effektivt at screene fodringsadfærden hos fluerne, der fodres med hver koncentration af eksperimentelle kemiske42,43,44. Tilstedeværelsen eller fraværet af blå i fluens mave-tarmkanal indikerer, om fluen har spist det giftstofholdige medium. Selvom der findes mere sofistikerede metoder til vurdering af fluefodringsadfærd, såsom Fly Liquid-Food Interaction Counter45, er denne kvalitative metode bedre egnet til screening med højere gennemstrømning.
Et bemærkelsesværdigt aspekt ved denne protokol er, at den er optimeret til en eksponeringsperiode på 48 timer uden behov for at overføre fluer eller tilføje yderligere væske til eksponeringshætteglasset. Brug af et fugtighedskammer og placering af kamrene i en inkubator, der holdes ved høj luftfugtighed, forhindrede filterpapiret indeholdende fødemediet i at tørre ud i løbet af denne tidsramme. Protokollen kan tilpasses til længere eksponeringsvarighed, men metoden skal justeres for at sikre, at filterpapiret ikke bliver tørt og forårsager signifikante ændringer i opløsningskoncentration eller dødelighed på grund af udtørring.
Endelig er et vigtigt kendetegn ved denne protokol, at den let kan rumme genetiske varianter, hvilket gør det muligt for forskere at udnytte det store udvalg af genetiske værktøjer til Drosophila til at udvide disse foreløbige undersøgelser af vildtypeorganismer for bedre at forstå mekanismer for kemisk virkning in vivo. I denne henseende kunne protokollen skitseret ovenfor let ændres for at supplere en tidligere beskrevet JoVE-protokol af Peterson og Long, der giver mulighed for toksikologisk analyse af vildtfangede fluer18.
På grund af den brede vifte af tidligere undersøgelser af toksiciteten af natriumarsenit i Drosophila 32,33,34,35,36, Oregon-R fluer blev behandlet med denne forbindelse for at demonstrere effektiviteten af vores system. Hanfluer udviste en LD 50 på 0,65 mM, og hunner udviste en LD50 på 0,90 mM. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser af natriumarsenit-behandlede voksne Drosophila. For eksempel fandt Goldstein og Babich37, at 50% af fluerne (blandede køn) døde efter 7 dages eksponering for 0,5 mM NaAsO2. Selvom dette er en lidt lavere dosis end i øjeblikket blev observeret, forklarer forskellene mellem deres metoder og denne metode (herunder brugen af faste eksponeringsmedier, en længere tidsskala og blandede køn) sandsynligvis denne forskel. Det er vigtigt, at begge metoder resulterede i generelt lignende LD50-værdier.
Observationer fra eksperimenter ved hjælp af denne protokol kan bruges til at finde genetiske og molekylære mål for efterfølgende adfærdsmæssige eller mekanistiske undersøgelser. Eksponeringsmetoden kan også bruges til behandling af Drosophila til prøveudtagning for metabolomics og proteomics, hvilket gør denne protokol velegnet til det voksende felt inden for præcisionstoksikologi (modelleret fra præcisionsmedicinfeltet46). I denne henseende kan eksponerede fluer indsamles efter trin 8 til efterfølgende genomisk og metabolomisk analyse. Prøver indsamlet i trin 8 kan derefter behandles, som beskrevet af Li og Tennessen47, begyndende med trin 3.
I sidste ende vil de data, der er erhvervet fra de ovenfor beskrevne eksperimenter, såvel som eventuelle efterfølgende metabolomiske og proteomiske data, ideelt set blive brugt i sammenligninger på tværs af arter. Som tidligere nævnt26 er sådanne undersøgelser på tværs af arter kraftfulde og i stand til at bestemme, hvordan individuelle kemikalier interfererer med bevarede biologiske veje. Således kan protokollen beskrevet ovenfor bruges til at finde evolutionære fællestræk som reaktion på individuelle toksiske stoffer på tværs af phyla og hjælpe med at informere kemikaliesikkerhedsregulering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker vores medarbejdere for hjælp med test og optimering af denne protokol: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge og Noelle Zolman. Vi takker også vores kolleger fra Precision Toxicology Group, især vores Exposure Group-kolleger, for at hjælpe med at identificere målene i protokollen.
Dette projekt modtog finansiering fra EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 965406. Det arbejde, der præsenteres i denne publikation, blev udført som en del af ASPIS-klyngen. Denne produktion afspejler kun forfatternes synspunkter, og Den Europæiske Union kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri. Denne publikation blev også muliggjort med støtte fra Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, som delvist finansieres af Award Number UL1TR002529 fra National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Dele af dette projekt blev støttet af midler fra Indiana University tildelt JRS og PhyloTox-konsortiet. JMH og EMP blev støttet af NIH award P40OD018537 til Bloomington Drosophila Stock Center.
1.5 inch flower lever action craft punch | Bira Craft | HCP-115-024 | |
15 mL Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL |
2 ml Tubes | VWR | 16466-044 | Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom |
5 ml Tubes | VWR | 60818-576 | Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430290 | 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap |
Benchmark Dose Software version 3.2 | U.S. Environmental Protection Agency | ||
Cardboard trays | Genesee Scientific flystuff | 32-122 | trays and dividers for narrow vials |
CO2 gas pads | Genesee Scientific flystuff | 59-114 | FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus |
Combitips advanced, 50 mL | Eppendorf | 0030089693 | Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips |
Cotton balls | Genesee Scientific flystuff | 51-101 | Cotton balls, large, fits narrow vials |
Delicate task wipes | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39" |
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) | VWR | 89168-888 | Wide |
FD&C Blue No. 1 | Spectrum Chemical | FD110 | CAS number 3844-45-9 |
Flies | BDSC | Stock #2057 | OregonR wildtype |
Gloves (nitrile) | Kimtech | 55082/55081/55083 | Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" |
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper | Cytvia | 3001-917 | Sheet, 46 x 57 cm |
Mesh for humidity chamber | |||
Multipette / Repeater (X) stream | Eppendorf | 022460811 | Repeater Xstream |
Plastic grate | Plaskolite | 18469 (from lowes) | Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs |
Plastic trays for glass vials | Genesee Scientific flystuff | 59-207 | Narrow fly vial reload tray |
Polypropylene Drosophila Vial | VWR | 75813-156 | Wide (28.5 mm) |
Rubbermaid tubs | Rubbermaid | 3769017 (from Lowes) | Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H |
Sucrose ultra pure | MP Biomedicals, Inc. | 821721 | |
Tube racks for wide-mouthed tubes | Thermo scientific | 5970-0230 | Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes |
Water Purification System | Millipore Milli-Q | ZMQ560F01 | Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier |
Yeast extract | Acros Organics | 451120050 | CAS number 84604-16-0 |