Bedömning av kemisk toxicitet hos vuxna Drosophila melanogaster

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv och billig metod som använder flytande media för att bedöma effekterna av kemiska toxiska ämnen på livskraften hos vuxna Drosophila melanogaster.

Abstract

Mänskliga industrier genererar hundratusentals kemikalier, varav många inte har studerats tillräckligt för miljösäkerhet eller effekter på människors hälsa. Denna brist på kemikaliesäkerhetsinformation förvärras av nuvarande testmetoder på däggdjur som är dyra, arbetsintensiva och tidskrävande. Nyligen har forskare och tillsynsmyndigheter arbetat för att utveckla nya metoder (NAM) för kemikaliesäkerhetstestning som är billigare, snabbare och minskar djurens lidande. En av de viktigaste NAMs som kommer att dyka upp är användningen av ryggradslösa organismer som ersättning för däggdjursmodeller för att belysa bevarade kemiska verkningssätt över avlägset besläktade arter, inklusive människor. För att främja dessa ansträngningar beskriver vi här en metod som använder bananflugan, Drosophila melanogaster, för att bedöma kemikaliesäkerheten. Protokollet beskriver en enkel, snabb och billig procedur för att mäta livskraften och utfodringsbeteendet hos exponerade vuxna flugor. Dessutom kan protokollet enkelt anpassas för att generera prover för genomiska och metabolomiska metoder. Sammantaget representerar protokollet ett viktigt steg framåt för att etablera Drosophila som en standardmodell för användning inom precisionstoxikologi.

Introduction

Människor utsätts ständigt för kemikalier från en mängd olika källor, inklusive luft¹, mat 2, vatten^3,4, mediciner⁵, rengöringsmedel⁶, personliga hygienprodukter 7^, industrikemikalier 7 och byggmaterial ⁷. Dessutom introduceras tusentals nya kemikalier varje år⁸, varav många inte kontrolleras ordentligt med avseende på hälso- och miljösäkerhet. Denna brist på lämpliga kemiska säkerhetstester beror delvis på en övertro på däggdjursmodeller, såsom möss och råttor. Även om sådana gnagarmodeller är informativa är kemikaliesäkerhetstester i dessa system dyra, tidskrävande och orsakar ofta oacceptabla nivåer av lidande för försöksdjuret⁹.

De ekonomiska och etiska bördor som är förknippade med kemiska säkerhetstester för däggdjur, liksom den tidskrävande karaktären hos däggdjursstudier, är viktiga bidragande faktorer till bristen på data kring nya kemikalier. För att ta itu med denna fråga genomför U.S. Environmental Protection Agency (EPA), European Chemicals Agency (ECHA), Health Canada och andra myndigheter åtgärder som införlivar nya metoder (NAMs) i regelverk¹⁰, vilket placerar nordamerikansk och europeisk politik i linje med internationella mål att ersätta, minska och förfina användningen av djur (3R-principen)^{11, 12,13,14}. NAMs omfattar en mängd olika analyser som främst bygger på in vitro- och in silico-modeller som ger en mekanistisk förståelse av kemisk toxicitet i stället för att observera motgångar som däggdjurstestarter utsätts för, vilket ökar datagenereringshastigheten för kemisk riskbedömning samtidigt som de fortfarande producerar högkvalitativa resultat¹⁵. Dessa metoder har dock ännu inte bevisats skydda mot systemisk toxicitet, inklusive störning av vitala biologiska processer som involverar interorgankommunikation och endokrin signalering. Vidare kan de inte redogöra för bioackumulering av kemikalier inom specifika vävnader, förmågan hos enskilda föreningar att absorberas och utsöndras och samspelet mellan beteende och kemisk exponering.

På grund av begränsningarna hos in vitro– och beräkningsmodeller bör framgångsrik användning av NAMs för att minska eller ersätta däggdjursmodeller även omfatta ryggradslösa djur in vivo-modeller, såsom bananfluga, Drosophila melanogaster. Tidigare studier på flugan har visat att denna organism är väl lämpad för att studera de bevarade genetiska vägarna som skyddar djurceller mot toxiska molekyler 16,17,18,19,20,21,22. Dessutom visar flugan anmärkningsvärd genetisk likhet med människor, inklusive funktionella homologer till över 65% av mänskliga sjukdomar 23,24,25 och ett ännu större bevarande av viktiga funktionella vägar ²⁶. Dessa egenskaper, i kombination med deras relativt korta livscykel, låga underhållskostnader och lätt observerbara beteendemässiga svar, gör Drosophila väl lämpad för användning som toxikologisk modell^27,28,29,30. Dessutom har flugor mycket högre genomströmning än gnagarmodeller och fångar effekter på metabolism, fysiologi och hormonsignalering som inte lätt kan detekteras av andra icke-organismella NAMs⁹.

Protokollet som beskrivs här utgör ett ramverk för att testa effekterna av kemisk exponering på vuxen Drosophila. Metoden är utformad för att vara effektiv, billig och reproducerbar, samtidigt som den minimerar den tid som forskare måste vara i kontakt med testkemikalien och tillmötesgående provinsamling för metabolomik och andra omics-metoder. Protokollet är optimerat för att testa en enda kemikalie per experiment, men kan enkelt rymma andra experimentella parametrar, såsom olika lösningsmedel eller kombinationer av kemikalier.

Protocol

OBS: Använd nitrilhandskar för alla steg i detta protokoll. Använd en laboratorierock, ögonskydd och / eller andningsskydd, enligt säkerhetsdatabladen för varje utvärderad kemikalie. 1. Beredning av injektionsflaska och fuktkammare Steg 1.1-1.5 kan slutföras när som helst innan de andra experimentavsnitten påbörjas. Nitrilhandskar måste alltid användas under beredningen av injektionsflaskan för att förhindra kontaminering. Stapla fyra ark cellulosakromatografipapper av klass 1 (se materialförteckning) och skär dem i 2 i breda remsor. Stansa ut blomformade filterpappersinsatser med en 1,5-tums pappersstans som innehåller en blomformad form. Använd en 22 mm x 220 mm olackerad träplugg för att trycka filterpapperet till botten av en 28,5 mm diameter polypropenflaska. Bekräfta att bunten med filterpapper sitter ordentligt på injektionsflaskans botten. Förvara de förberedda injektionsflaskorna i plast- eller kartongbrickor och placera brickorna i stora (~ 280 mm x 240 mm) plastpåsar tills de används. Konstruera en fuktkammare genom att klippa ett hål på 120 mm x 280 mm i plastlocket på en 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm plastbehållare (se materialförteckning). Limma nät över hålet för att tillåta luftflöde. Skär en sektion av plastgallret från lamelltakljuspaneler (ursprungligen 610 mm x 1220 mm) för att passa i botten av plastkaret som användes i steg 1.4.OBS: En mängd olika plastkar och plast / metallgallermaterial kan användas för att bygga en fuktighetskammare. 2. Flughållning Startkulturer av vuxna flugor (minst 30 vuxna) i glasmjölkflaskor som innehåller standard Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) media31. Stäng flaskorna med en rayonplugg insvept i en känslig arbetsduk. Träng inte flaskorna.OBS: Antalet flaskor som krävs beror på antalet kemiska exponeringar som utförs och teststammens genotyp. Normalt kan flera hundra flugor erhållas från en enda flaska när man använder robusta och fecund lager. Standardanalysen använder Oregon-R vildtypflugor (BDSC-lager #2057), men alla genotyper av intresse kan användas med detta protokoll. Kom ihåg att komprometterade genotyper med låg fruktsamhet och / eller livskraft kräver ökade flaskkulturer. Inkubera brickorna med odlingsflaskor vid 25 °C med cirka 60 % luftfuktighet och en ljus:mörk cykel på 12:12 timmar tills det tredje larvinstjärne- eller tidiga valpstadiet observeras. Detta stadium kan identifieras genom närvaron av larver som vandrar upp på flaskans sidor och utseendet på puppar på flaskväggar.OBS: Hantera endast flugor under ljusperioden på 12:12 h ljus: mörk cykel. För robusta lager når flaskorna detta stadium efter 3-4 dagar under de beskrivna förhållandena.Ta bort vuxna flugor och bestäm medias likviditet. Om mediet flyter längs flaskans sida när det är inverterat är mediet för flytande. Sätt in en känslig arbetsduk eller en rayonkula i botten av flaskan för att stelna flugmaten. När flugorna börjar stänga, rensa alla vuxna från flaskorna och låt pupporna fortsätta att stänga i 48 timmar. Vid denna tidpunkt kan alla vuxna som rensas från odlingsflaskorna antingen överföras till nya flaskor för att sprida lagren (se steg 2.1) eller kasseras. Överför flugor som försluts under 48-timmarsperioden till nya flaskor som innehåller standard BDSC-media. Ålder i 3 dagar.OBS: De vuxna i dessa flaskor är 3-5 dagar gamla och kan användas i dödligheten och utfodringsexperimenten. Flaskorna som används för att åldra vuxna flugor kommer att innehålla ägg och larver. Som ett resultat kan dessa flaskor användas för att sprida nästa generation flugor. 3. Beredning av flugor för kemisk exponering Bedöva 5-7 dagar gamla flugor med CO2. Sortera de bedövade flugorna efter kön med hjälp av deras könsorgan. För hjälp med att bedöva och könsbestämma flugor, se referens28. Placera grupper om antingen 20 manliga eller 20 kvinnliga flugor i flaskor som innehåller standard BDSC-media. Stäng injektionsflaskan med en rayonplugg och förvara injektionsflaskorna med hanar och honor separat. Markera flaskorna som innehåller kvinnliga flugor med en rand. Lämna injektionsflaskorna med hanflugor omärkta för att undvika att oavsiktligt blanda könen.OBS: Antalet injektionsflaskor som måste beredas i steg 3.2 bestäms av storleken på exponeringsexperimenten. Som beskrivs i steg 5.3 och 5.6 kräver ett typiskt intervallfinnande experiment för en enda testkemikalie minst 40 injektionsflaskor med hanar och 40 injektionsflaskor med honor. Ett standardexperiment med dos-responskurva, som beskrivs i steg 7.4 och 7.8, kräver minst 63 injektionsflaskor med hanar och 63 injektionsflaskor med honor. Förvara injektionsflaskorna i 48 timmar i en inkubator vid 25 °C vid cirka 60 % luftfuktighet och med en 12:12 h ljus:mörk cykel. Under denna tid, stötta brickan med sorterade flaskor i 60 ° vinkel för att förhindra att flugor fastnar i maten medan de återhämtar sig från anestesin.OBS: Detta steg gör att flugor kan återhämta sig från CO 2-anestesin. Bedöva inte flugorna igen under återstoden av exponeringsprotokollet. Efter återhämtningsperioden på 48 timmar tillsätts 0,75 ml sterilt renat vatten till injektionsflaskorna som beretts i steg 1.3. Antalet injektionsflaskor som bereds i detta steg ska vara identiskt med antalet injektionsflaskor som ställdes upp i steg 3.2. Överför sorterade, könsmatchade flugor till svältflaskan genom att öppna injektionsflaskan av glas som innehåller flugorna från steg 3.2, stoppa den i munnen på den förberedda plastflaskan och sedan knacka plastflaskans botten mot en bänkskiva. Stäng plastflaskan med en cellulosaacetatplugg (allmänt känd som en fluga).Registrera eventuella flugor som förlorats vid denna överföring (överför senare till register över startantalet flugor för varje injektionsflaska). Markera svältflaskor som innehåller kvinnliga flugor med en rand. Lämna injektionsflaskorna med hanflugor omärkta för att undvika att oavsiktligt blanda könen. Förbered fuktighetskammaren för exponering över natten. Se steg 1.4–1.5 för en beskrivning av hur du bygger denna kammare.Placera sex vanliga pappershanddukar i botten av fuktkammaren. Blötlägg pappershanddukarna med 100 ml vatten. Lägg plastgallret (steg 1.5) över de våta handdukarna för att säkerställa att injektionsflaskorna inte kommer i kontakt med de mättade pappershanddukarna. Placera brickorna med svältflaskor i ett horisontellt läge i fuktighetskamrarna. Placera fuktkamrarna i en 25 °C inkubator (vid cirka 60 % luftfuktighet) över natten.OBS: Helst varar svältperioden över natten cirka 16 timmar; Tidpunkten kan dock justeras för individuella labbscheman. 4. Beredning av stamlösningar Anmärkning: Flugor matas med testkemikalier i flytande jäst-sackarossubstrat. I detta avsnitt beskrivs beredning av stamlösningar av koncentrerade matningsmedier och testkemikalier. Bered en 4x jäst-sackaroslösning innehållande 16% sackaros och 6% jästextrakt (m / v) (se materialtabell) upplöst i sterilt renat vatten. Autoklav lösningen på en vätskecykel under lämplig steriliseringstid (t.ex. 40 min för 1 liter).Anmärkning: Lösningen kan tillverkas i bulk och lagras i alikvoter vid -20 °C. Tina enskilda alikvoter 1 dag före användning genom att placera dem i ett kylskåp på 4 °C. Bered ett lager av testkemikalien. För det första experimentet bör stamlösningen göras i högsta koncentration så att kemikalien kan lösas fullständigt i vatten.Andra lösningsmedel än vatten kan användas för att lösa upp testkemikalien. Se diskussionen om försiktighetsåtgärder för användning av alternativa lösningsmedel. Bered en 100x blå färgämneslösning genom att lösa 1 g FD&C Blue No. 1 (se materialtabell) i 10 ml sterilt renat vatten.OBS: Den blå färglösningen kan tillverkas i bulk och lagras i alikvoter vid 4 °C. 5. Beredning av injektionsflaskor: experiment med att fastställa intervall Steg 5 och 6 i protokollet är utformade för att identifiera den lägsta dosen av testkemikalien som inducerar 100 % dödlighet och den högsta dos som inte inducerar en dödlig fenotyp. Om dessa koncentrationer redan har bestämts genom tidigare försök, se steg 7 och 8 för beräkning av en dos-responskurva. Exponeringsmedier måste beredas omedelbart innan flugor tillsätts till exponeringsflaskorna. Märk åtta 15 ml centrifugrör enligt följande: (i) ingen kemikalie, (ii) högsta koncentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1,000. Bered exponeringsmediet i de märkta centrifugrören från steg 5.1 genom att först tillsätta 2,5 ml 4x jäst/sackaroslösning till alla åtta märkta rören.Tillsätt 7,5 ml sterilt renat vatten till röret märkt “ingen kemikalie”. Denna utspädning är den negativa kontrollen. Tillsätt 7,4 ml stamlösning av testkemikalien till röret märkt “högsta koncentration”. Tillsätt 100 μL sterilt renat vatten till detta rör, så den slutliga volymen är 10 ml. Beräkna och registrera testkemikaliens molaritet i denna lösning.OBS: Tillsatsen av 100 μL sterilt renat vatten till röret säkerställer att den kemiska koncentrationen i detta steg är identisk med den som användes i steg 5.5, där en blå färgstamlösning tillsätts exponeringsmediet som en metod för att bedöma utfodringsbeteendet. Tillsätt lämplig mängd stamlösning av testkemikalien och sterilt renat vatten till de återstående rören. Den slutliga volymen för varje rör måste vara 10 ml. Den slutliga koncentrationen av testkemikalier i dessa rör i förhållande till röret med “högsta koncentration” måste vara 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1 000. Bered och märk åtta exponeringsflaskor för varje enskild koncentration av exponeringsmedier som genererats i steg 5.1. Det ska finnas åtta uppsättningar injektionsflaskor (totalt 64 injektionsflaskor) som innehåller följande etiketter: ingen kemikalie, högsta koncentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1 000.Överför med pipett 0,75 ml exponeringsmedium berett i steg 5.2.3 till motsvarande uppsättning exponeringsflaskor. Märk åtta 5 ml enskilda rör enligt följande: (i) ingen kemikalie, (ii) högsta koncentration, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1 000. Bered exponeringsmedier för blått färgämne genom att först blanda 500 μl 4x stamlösning av jäst/sackaros och 20 μl stamlösning av blått färgämne i åtta märkta 5 ml rör.Tillsätt 1,48 ml sterilt renat vatten till röret märkt “ingen kemikalie”. Denna utspädning är den negativa kontrollen. Tillsätt 1,48 ml stamlösning av testkemikalien till röret märkt “högsta koncentration”. Inget vatten tillsätts till detta rör. Beräkna och registrera testkemikaliens molaritet i denna lösning. Tillsätt lämplig mängd stamlösning av testkemikalien och sterilt renat vatten till de återstående rören. Den slutliga volymen av varje rör ska vara 2 ml. Den slutliga koncentrationen av testkemikalien i dessa rör i förhållande till röret med “högsta koncentration” bör vara 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1 000. Bered och märk två injektionsflaskor med varje enskild koncentration av blått exponeringsmedium. Det ska finnas åtta uppsättningar injektionsflaskor (totalt 16 injektionsflaskor) som innehåller följande etiketter: ingen kemikalie, högsta koncentration, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 och 1:1 000. Ordet “blå” bör också skrivas på dessa injektionsflaskor.Pipettera 0,75 ml blått exponeringsmedium till motsvarande uppsättning blå exponeringsflaskor. 6. Flygkemisk exponering: Experiment för att hitta intervall Bered injektionsflaskorna med kemisk exponering med hjälp av injektionsflaskorna med svältflugor över natten från steg 3.7 enligt följande:Överför fyra injektionsflaskor med utsvultna honflugor (20 flugor per injektionsflaska) till fyra exponeringsflaskor med varje kemisk koncentration. Märk dessa injektionsflaskor “kvinnliga”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Överför fyra injektionsflaskor med utsvultna hanflugor (20 flugor per injektionsflaska) till fyra injektionsflaskor med varje kemisk koncentration. Märk dessa injektionsflaskor “manliga”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Bered injektionsflaskor med kemisk exponering som innehåller blått färgämne med hjälp av injektionsflaskorna med svältflugor över natten från steg 3.7 enligt följande:Överför en injektionsflaska med utsvultna honflugor (20 flugor per injektionsflaska) till en blå injektionsflaska för varje kemisk koncentration. Märk denna injektionsflaska “kvinna”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Överför en injektionsflaska med utsvultna hanflugor (20 flugor per injektionsflaska) till en blå exponeringsflaska för varje kemisk koncentration. Märk denna injektionsflaska “manlig”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Anteckna antalet flugor som finns i varje injektionsflaska efter överföring och notera antalet som dött eller rymt. Normalt bör alla 20 flugor överleva svält och överföring över natten. Placera exponeringsflaskorna horisontellt i nyberedda fuktkammare (se steg 3.6 för beredning av fuktkammare). Placera kamrarna i en 25 °C inkubator med ca 60% luftfuktighet och en 12:12 h ljus:mörk cykel. Undersök injektionsflaskorna vid 24 och 48 timmar efter det att den kemiska exponeringen har börjat. Räkna och registrera antalet döda flugor i varje injektionsflaska vid varje tidpunkt.OBS: Döden används som avläsning för denna analys, men protokollet kan anpassas för att undersöka andra fenotyper. Exponerade flugor samlas vanligen in vid dessa tidpunkter för transkriptomiska och metabolomiska studier. Undersök injektionsflaskorna med blå exponering 24 timmar efter det att den kemiska exponeringen har börjat. Använd följande tekniker för att avgöra om exponerade flugor förbrukade det blå exponeringsmediet:Undersök injektionsflaskans väggar för tecken på blå avföring, som visas som små prickar på sidan av exponeringsflaskan samt på flugan. Bedövar flugorna med CO2 och undersök buken för närvaron av blått färgämne.OBS: Normalt analyseras injektionsflaskor med blå exponering efter 24 timmar. Detta steg kan dock utföras vid 48 timmar istället. Flugor som har ätit normalt har en blå rand genom buken, vilket indikerar att exponeringsmediet har kommit in i tarmen. Undersök flugorna för onormala utfodringsbeteenden, såsom uppstötningar, grödans distension och nedbrytning av tarmbarriärfunktionen (indikeras av utseendet av blått färgämne i hela organismen snarare än bara begränsat till GI-kanalen, vanligen kallad smurfing32,33). Kassera alla förorenade flaskor, filterpapper, flugor och flugor i lämpliga behållare för kemiskt avfall. Om levande flugor finns kvar i flaskorna, frys injektionsflaskorna för att döda flugorna innan du slänger dem i rätt avfallsbehållare.OBS: Bortskaffande av exponeringsflaskor och flugor dikteras av kemikalien (erna) som analyseras i experimentet. Följ alltid de kemikaliesäkerhetsrutiner som beskrivs i kemikaliesäkerhetsdatabladet. Om de koncentrationer som används i det intervallfinnande experimentet dödar flugor vid den lägsta dosen, upprepa avsnitt 6 med en spädningsserie och börja med den lägsta koncentrationen som dödade 100 % av djuren. 7. Beredning av injektionsflaskor: Framställning av en dos-responskurva OBS: Protokollet som beskrivs i steg 5 och 6 är utformat för att i stort sett bestämma den kemiska koncentration som krävs för att framkalla en fenotyp. Steg 7 och 8 i protokollet används för att beräkna en exakt dos-responskurva. Beräkna de koncentrationer av testkemikalier som måste analyseras för att generera en dos-responskurva med hjälp av följande metod:Bestäm den lägsta koncentration av testkemikalien som dödar 100 % av de exponerade flugorna vid 48 timmar. Bestäm den högsta koncentration av testkemikalien som inte påverkar viabiliteten vid 48 timmar. Beräkna ytterligare fyra koncentrationer som är jämnt fördelade mellan de koncentrationer som bestämts i steg 7.1.1 och 7.1.2. Märk nio enskilda 15 ml centrifugrör med molariteten för följande koncentrationer: i) ingen kemikalie, ii) koncentration bestämd i steg 7.1.1, iii) koncentration bestämd i steg 7.1.2, iv) koncentrationer bestämd enligt 7.1.3, v) två gånger den koncentration som bestämdes i steg 7.1.1, vi) en 1:2 utspädning av koncentrationen bestämd i steg 7.1.2.Anmärkning: Att inkludera de koncentrationer som är dubbelt så höga som de koncentrationer som bestämdes i 7.1.1 och en utspädning 1:2 av den som bestämdes i steg 7.1.2 är viktigt för en korrekt beräkning av dos-responskurvan. Bered exponeringsmediet genom att först tillsätta 2,5 ml 4x jäst/sackaroslösning till nio märkta enskilda 15 ml centrifugrör som beretts i steg 7.2.Tillsätt 7,5 ml sterilt renat vatten till röret märkt “ingen kemikalie”. Denna utspädning är den negativa kontrollen. Tillsätt lämplig mängd stamlösning av testkemikalien och sterilt renat vatten till de återstående rören. Den slutliga volymen för varje rör måste vara 10 ml. Den slutliga koncentrationen av kemikalier i ett enskilt rör bör vara lika med den som skrivs på utsidan av röret. Bered och märk 12 exponeringsflaskor för varje koncentration av exponeringsmedier som genererades i steg 7.2. Det ska finnas nio uppsättningar injektionsflaskor (totalt 108 injektionsflaskor). Pipettera 0,75 ml exponeringsmedium till motsvarande uppsättning exponeringsflaskor.Steg 7.6 till 7.8 är valfria. Om det är känt att de koncentrationer av testkemikalien som bereds i steg 7.2 inte påverkar utfodringsbeteendet kan dessa steg hoppas över. Bered och märk nio olika 5 ml rör för blå exponeringsmedier med samma koncentrationsserie som användes i steg 7.2. Bered exponeringsmedier för blått färgämne genom att först blanda 500 μl stamlösning av 4x jäst/sackaros och 20 μl stamlösning av blått färgämne.Tillsätt 1,48 ml renat sterilt vatten till röret märkt “ingen kemikalie”. Denna utspädning är den negativa kontrollen. Tillsätt lämplig mängd stamlösning av testkemikalien och renat sterilt vatten till de återstående rören. Den slutliga volymen för varje rör måste vara 2 ml. Den slutliga koncentrationen av kemikalier i ett enskilt rör bör vara lika med den som skrivs på utsidan av röret. Bered och märk två exponeringsflaskor för varje enskild koncentration av blå exponeringsmedier. Det ska finnas nio uppsättningar injektionsflaskor (totalt 18 injektionsflaskor), där varje uppsättning injektionsflaskor är märkta med de koncentrationer som anges i steg 7.2. Ordet “blå” bör också skrivas på dessa injektionsflaskor.Pipettera 0,75 ml blått exponeringsmedium till motsvarande uppsättning blå exponeringsflaskor. 8. Flygkemisk exponering: Generera en dos-responskurva Bered injektionsflaskorna med kemisk exponering med hjälp av injektionsflaskorna med svältflugor över natten från steg 3.7 enligt följande:Överför sex injektionsflaskor med utsvultna honflugor (20 flugor per injektionsflaska) till sex exponeringsflaskor med varje kemisk koncentration. Märk dessa injektionsflaskor “kvinnliga”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Överför sex injektionsflaskor med utsvultna hanflugor (20 flugor per injektionsflaska) till sex injektionsflaskor med varje kemisk koncentration. Märk dessa injektionsflaskor “manliga”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Bered injektionsflaskor med kemisk exponering som innehåller blått färgämne med hjälp av injektionsflaskorna med svältflugor över natten från steg 3.7 enligt följande:Överför en injektionsflaska med utsvultna honflugor (20 flugor per injektionsflaska) till en blå injektionsflaska för varje kemisk koncentration. Märk denna injektionsflaska “kvinna”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Överför en injektionsflaska med utsvultna hanflugor (tjugo flugor per injektionsflaska) till en blå exponeringsflaska för varje kemisk koncentration. Märk denna injektionsflaska “manlig”. Använd samma överföringsmetod som beskrivs i steg 3.5. Anteckna antalet flugor i varje injektionsflaska efter överföringen. Normalt bör alla 20 flugor överleva svält och överföring över natten, men se till att alla som dog eller flydde under överföringen subtraheras från totalen. Placera exponeringsflaskorna horisontellt i nyberedda fuktkammare (se steg 3.6 för beredning av fuktkammare). Placera kamrarna i en 25 °C inkubator med ca 60% luftfuktighet och en 12:12 h ljus:mörk cykel. Undersök injektionsflaskorna vid 24 och 48 timmar efter det att den kemiska exponeringen har börjat. Räkna och registrera antalet döda flugor i varje injektionsflaska vid varje tidpunkt. Undersök injektionsflaskorna med blå exponering 24 timmar efter det att den kemiska exponeringen har börjat. Använd metoden som beskrivs i steg 6.6 för att bedöma förändringar i utfodringsbeteende. Kassera alla förorenade flaskor, filterpapper, flugor och flugor i lämpliga behållare för kemiskt avfall. Om levande flugor finns kvar i flaskorna, frys injektionsflaskorna för att döda flugorna innan de kastas i rätt avfallsbehållare.OBS: Bortskaffande av exponeringsflaskor och flugor dikteras av kemikalien (erna) som analyseras i experimentet. Följ alltid de kemikaliesäkerhetsrutiner som beskrivs i kemikaliesäkerhetsdatabladet. 9. Beräkning av dos-responskurva Använd programvaran för benchmarkdos (BMDS, version 3.2; se Materialförteckning) eller annan liknande programvara för att analysera data34. Nedan beskrivs arbetsflödet med BMDS-programvaran. Klicka på fliken Data i BMDS och klicka på infoga ny datauppsättning. Ange antalet exempel i datauppsättningen, klicka på dikotom och klicka sedan på skapa datauppsättning. Ange varje replikat som en enskild rad i datauppsättningen. Ange dosen i den första kolumnen i den genererade tabellen, startantalet flugor exklusive de som dött eller förlorats före steg 8.3) i den andra kolumnen och antalet flugor som dött av kemisk exponering i den tredje kolumnen. Klicka på fliken Huvud i BMDS. Klicka på rullgardinspilen för menyn Välj modelltyp och klicka på Dikotom. Klicka på aktivera för datauppsättningen från steg 9.2 i tabellen Datauppsättningar. Klicka på rutorna för önskade modeller för analys i tabellen MLE och alternativ.OBS: Frequentist Restricted Dichotomous Hill-modellen användes främst. Klicka på Kör analys. Programmet genererar en utdatafil med dödlighetskurvan och ytterligare information om modellen/modellerna.

Representative Results

Flugan har länge fungerat som modell i studier för bestämning av natriumarsenit (NaAsO2) toxicitet35,36,37,38. För att demonstrera protokollets effekt exponerades manliga och kvinnliga flugor för NaAsO2, med målet att jämföra dessa resultat med tidigare studier. Med hjälp av den metod som beskrivs ovan exponerades vuxna Oregon-R (BDSC-lager #2057) män och kvinnor för ett intervall av NaAsO 2-koncentrationer (0, 0,01, 0,02, 0,1, 0,2, 1 och2 mM) och fick för dödlighet 48 timmar efter exponeringens början (figur 1A, B). Syftet med denna inledande analys var att identifiera det ungefärliga koncentrationsintervallet som skulle möjliggöra en mer exakt karakterisering avNaAsO2-toxicitet. I efterföljande experiment valdes koncentrationer (0, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 och 5 mM) som mer exakt definierade NaAsO 2-dos-responskurvan (figur 1C, D). Observera att den resulterande analysen undersökte flera koncentrationer som inducerade 100% dödlighet. Data analyserades med hjälp av Naturvårdsverkets offentligt tillgängliga Benchmark Dose Software version 3.2.0.125. Data modellerades som “dikotom” och Dichotomous Hill-modellen användes för efterföljande analyser. Baserat på denna modell var den slutliga LD10, LD 25 och LD 50 av hanflugor som matades NaAsO2 0,30 mM,0,50 mM respektive0,65 mM. För honflugor var dessa värden något högre, med en LD10 på 0,30 mM, en LD25 på 0,65 mM och en LD50 på 0,90 mM. Sammantaget liknar de värden som erhållits med denna metod dem som tidigare rapporterats för arseniktoxicitet i Drosophila melanogaster35,36,37,38, vilket validerar metoden. Förutom de sex replikat som användes för att beräkna dos-responskurvan matades manliga och kvinnliga flugor också NaAsO 2-exponeringslösningar som innehöll 1% FD&C-blått, vilket är lätt synligt i matsmältningskanalen med hjälp av ljusmikroskopi. Baserat på närvaron av blått färgämne i tarmen hos NaAsO 2-matade flugor fortsatte både manliga och kvinnliga flugor att mata 24 timmar efter början av den kemiska exponeringen, oavsett NaAsO 2-koncentrationen närvarande i det flytande mediet (figur 2). Den intagna födan observerades dock ibland upprepas vid doser över 0,2 mM för kvinnor och 0,5 mM för män (figur 2). Dessa fynd tyder på att uppstötningar kan tjäna en nyckelroll i Drosophila-svaret på arsenikförgiftning. Figur 1: Dos-responskurvor för Drosophila behandlade med NaAsO2 för män och kvinnor under 48 timmar. Alla grafer visar den uppskattade andelen döda flugor vid varje NaAsO2-koncentration som testats baserat på Dichotomous Hill-modellen. (A,B) Ett brett spektrum av NaAsO2-koncentrationer testades för att approximera den dos vid vilken varje flugkön börjar dö. (A) visar data om hanar och (B) visar uppgifter om kvinnor. N = 4 injektionsflaskor, med 20 flugor per injektionsflaska. (C,D) Ett smalare intervall av NaAsO2-koncentrationer testades för att bestämma exakta doser vid vilka 10%, 25% och 50% av varje kön av flugor dog. Dessa doser anges till höger om varje diagram. (C) visar data om män och (D) visar data om kvinnor. N = 6 injektionsflaskor, med 20 flugor per injektionsflaska. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Representativa resultat från blue dye assay av manligt och kvinnligt Drosophila behandlat med NaAsO2 i 24 timmar. Mikrografer visar flugor som matas ökande koncentrationer av NaAsO2. Rad (A) visar hanflugor och rad (B) visar honflugor, med koncentrationen av NaAsO2 som ökar från vänster till höger. Magen visar en liten mängd blått nära bröstkorgen vid låga koncentrationer, vilket indikerar att exponeringsmedia kom in i tarmen. Vid högre koncentrationer börjar blått färgämne ackumuleras runt munnen, vilket tyder på att exponeringsmedier återupplivas. Skalstången är 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Bananflugan Drosophila melanogaster växer fram som ett kraftfullt system för NAMs^16,18,19,21. Genom att utnyttja de oöverträffade genetiska resurser som finns tillgängliga för flugsamhället, i kombination med de senaste framstegen inom genomik och metabolomik, kan kemiska säkerhetsstudier med Drosophila snabbt identifiera de molekylära mekanismer genom vilka enskilda föreningar stör metabolism, fysiologi och cellsignalering (se till exempel³⁹). Detta billiga protokoll är utformat för att snabbt definiera dos-responskurvor och därefter generera prover för RNA-seq och metabolomikanalys. Dessutom kan detta flexibla protokoll anpassas för användning med alla genotyper och kan rymma många klasser av kemikalier.

En anmärkningsvärd aspekt av detta protokoll är valet av flytande livsmedel som används vid kemisk exponering, vilket är baserat på en tidigare studie, men skiljer sig från det fasta mediet som används av de flesta toxikologiska studier av Drosophila^18,22. Detta specifika flytande medium valdes för att återspegla näringsinnehållet i det vanliga, fasta BDSC-mediet som flugorna också matas i detta protokoll, för att säkerställa att flugorna får konsekvent näring. Enkelheten hos flytande matningsmedier har många fördelar. Flytande medier är lättare att hantera än fast föda, som antingen måste smältas och stelna eller rekonstitueras från pulver. Flytande medier ökar också systemets genomströmning, säkerställer jämn kemisk fördelning i matningsmediet och minskar tiden som används för att arbeta med farliga föreningar. Dessutom kräver mediet inte att lösningar värms upp, vilket underlättar testning av flyktiga testföreningar. På grund av de relativt få komponenter som ingår i livsmedelslösningen minimeras oönskade sidoreaktioner mellan testkemikalien och andra kostkomponenter. Jästen som används i maten är också inaktiv, vilket ytterligare begränsar matningsmediets reaktivitet. Observera dock att metoden inte är lämplig för testning av utvecklings- eller larvtoxicitet.

Några av de material som används i protokollet kan ersättas, till exempel att använda glasflugflaskor snarare än polypropen. De material som användes valdes dock för att vara både inerta och engångsbruk för att undvika oönskade kemiska reaktioner mellan reagens och kemiska exponeringar som kan uppstå vid rengöring av glasvaror.

Användningen av flytande mat kräver ett fordon för matleverans. Cellulosaacetatfilterpapper valdes för detta ändamål på grund av dess flexibilitet och inerta natur²⁸. Andra forskare använde liknande protokoll men med andra fordon, såsom känsliga arbetsdukar eller glasfiberfilter^29,30. Cellulosaacetatfilterpapperet passade dessa behov eftersom det är ett inert fordon som kan skäras till den perfekta formen för att passa in det i botten av flygflaskorna utan stora mellanrum mellan papperet och flaskans vägg, vilket förhindrar dödsfall på grund av att flugor fastnar i media eller själva fordonet.

En viktig begränsning av detta system är att den maximala testbara koncentrationen av en kemikalie är knuten till kemikaliens löslighet. Icke-vattenlösliga föreningar kräver ytterligare ett lösningsmedel, vilket kan leda till ytterligare eller synergistiska effekter med kemikalien av intresse. Detta kan också skapa situationer där det inte är möjligt att framställa stamlösningar som är tillräckligt koncentrerade för att uppnå önskat effektmått i alla organismer, vilket begränsar analysen av resulterande data³¹. För att ta itu med detta kan kemikalier med låg vattenlöslighet testas genom att tillsätta upp till 0,5% dimetylsulfoxid till livsmedelslösningen. Andra lösningsmedel kan också användas, men ytterligare forskning behövs för varje lösningsmedel av intresse för att bestämma den maximala acceptabla lösningsmedelskoncentrationen i lösningen för att maximera lösligheten samtidigt som lösningsmedelseffekterna på organismen minimeras.

Omfattande karakterisering av luktresponsen i Drosophila har beskrivit hur flugor undviker att konsumera giftiga föreningar^40,41, vilket leder till minskad utfodring på behandlade medier. Den blå färgämnesanalysen adresserar detta fenomen genom att tillåta forskare att effektivt screena utfodringsbeteendet hos flugorna som matas med varje koncentration av experimentell kemikalie^42,43,44. Närvaron eller frånvaron av blått i flugans mag-tarmkanal indikerar om flugan har ätit det giftiga mediet. Även om det finns mer sofistikerade metoder för att bedöma flugmatningsbeteenden, såsom Fly Liquid-Food Interaction Counter⁴⁵, är denna kvalitativa metod bättre lämpad för screening med högre genomströmning.

En anmärkningsvärd aspekt av detta protokoll är att det har optimerats för en exponeringsperiod på 48 timmar utan att behöva överföra flugor eller tillsätta ytterligare vätska till exponeringsflaskan. Genom att använda en fuktkammare och placera kamrarna i en inkubator som hölls vid hög luftfuktighet förhindrades filterpapperet som innehöll matningsmediet från att torka ut under denna tidsram. Protokollet kan anpassas för längre exponeringstider, men metoden måste justeras för att säkerställa att filterpapperet inte blir torrt och orsakar signifikanta förändringar i lösningskoncentration eller dödlighet på grund av uttorkning.

Slutligen är en viktig egenskap hos detta protokoll att det lätt kan rymma genetiska varianter, vilket gör det möjligt för forskare att använda det stora utbudet av genetiska verktyg för Drosophila för att utöka dessa preliminära studier på vildtypsorganismer för att bättre förstå mekanismer för kemisk verkan in vivo. I detta avseende kan det protokoll som beskrivs ovan lätt modifieras för att komplettera ett tidigare beskrivet JoVe-protokoll av Peterson och Long som möjliggör toxikologisk analys av vildfångade flugor¹⁸.

På grund av den stora variationen av tidigare studier om toxiciteten av natriumarsenit i Drosophila 32,33,34,35,36^, Oregon-R-flugor behandlades med denna förening för att visa effekten av vårt system. Manliga flugor uppvisade en LD 50 på 0,65 mM och kvinnor uppvisade en LD₅₀ på 0,90 mM. Detta stämmer överens med tidigare studier av natriumarsenitbehandlade vuxna Drosophila. Till exempel fann Goldstein och Babich³⁷ att 50% av flugorna (blandade kön) dog efter 7 dagars exponering för 0,5 mM NaAsO₂. Även om detta är en något lägre dos än vad som för närvarande observerades, förklarar skillnaderna mellan deras metoder och denna metod (inklusive användningen av fasta exponeringsmedier, en längre tidsskala och blandade kön) sannolikt denna skillnad. Det är viktigt att båda metoderna resulterade i övergripande liknande LD_50-värden.

Observationer från experiment med detta protokoll kan användas för att hitta genetiska och molekylära mål för efterföljande beteendemässiga eller mekanistiska studier. Exponeringsmetoden kan också användas för att behandla Drosophila för provtagning för metabolomik och proteomik, vilket gör detta protokoll väl lämpat för det växande området precisionstoxikologi (modellerat från precisionsmedicinfältet⁴⁶). I detta avseende kan exponerade flugor samlas in efter steg 8 för efterföljande genomisk och metabolomisk analys. Prover som samlats in i steg 8 kan sedan bearbetas, enligt beskrivningen av Li och Tennessen⁴⁷, med början från steg 3.

I slutändan skulle de data som erhållits från de ovan beskrivna experimenten, liksom eventuella efterföljande metabolomik- och proteomikdata, helst användas i jämförelser mellan arter. Som tidigare noterats²⁶ är sådana artöverskridande studier kraftfulla och kan bestämma hur enskilda kemikalier stör bevarade biologiska vägar. Således kan protokollet som beskrivs ovan användas för att hitta evolutionära likheter som svar på enskilda toxiska ämnen över phyla och hjälpa till att informera kemikaliesäkerhetsreglering.

Materials

1.5 inch flower lever action craft punch	Bira Craft	HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes	VWR	89039-666	High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes	VWR	16466-044	Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes	VWR	60818-576	Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	430290	50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2	U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays	Genesee Scientific flystuff	32-122	trays and dividers for narrow vials
CO2 gas pads	Genesee Scientific flystuff	59-114	FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus
Combitips advanced, 50 mL	Eppendorf	0030089693	Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls	Genesee Scientific flystuff	51-101	Cotton balls, large, fits narrow vials
Delicate task wipes	Kimtech	34155	Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs)	VWR	89168-888	Wide
FD&C Blue No. 1	Spectrum Chemical	FD110	CAS number 3844-45-9
Flies	BDSC	Stock #2057	OregonR wildtype
Gloves (nitrile)	Kimtech	55082/55081/55083	Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5"
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper	Cytvia	3001-917	Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream	Eppendorf	022460811	Repeater Xstream
Plastic grate	Plaskolite	18469 (from lowes)	Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials	Genesee Scientific flystuff	59-207	Narrow fly vial reload tray
Polypropylene Drosophila Vial	VWR	75813-156	Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs	Rubbermaid	3769017 (from Lowes)	Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure	MP Biomedicals, Inc.	821721
Tube racks for wide-mouthed tubes	Thermo scientific	5970-0230	Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes
Water Purification System	Millipore Milli-Q	ZMQ560F01	Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier
Yeast extract	Acros Organics	451120050	CAS number 84604-16-0