Den nåværende protokollen beskriver oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk teknikk for å generere biokompatible liposomer. OLA produserer monodispergerte liposomer i mikronstørrelse med effektiv innkapsling, noe som muliggjør umiddelbar eksperimentering på brikken. Denne protokollen forventes å være spesielt egnet for syntetisk biologi og syntetisk celleforskning.
Mikrofluidikk er et mye brukt verktøy for å generere dråper og vesikler av forskjellige slag på en kontrollert og høy gjennomstrømningsmåte. Liposomer er forenklede cellulære etterligninger sammensatt av et vandig interiør omgitt av et lipid-dobbeltlag; De er verdifulle i utformingen av syntetiske celler og forstå grunnleggende biologiske celler in vitro mote og er viktige for anvendt vitenskap, for eksempel lastlevering for terapeutiske applikasjoner. Denne artikkelen beskriver en detaljert arbeidsprotokoll for en on-chip mikrofluidisk teknikk, oktanolassistert liposommontering (OLA), for å produsere monodispergerte, mikronstore, biokompatible liposomer. OLA fungerer på samme måte som bobleblåsing, hvor en indre vandig (IA) fase og en omkringliggende lipidbærende 1-oktanolfase klemmes av av overflateaktive ytre væskestrømmer. Dette genererer lett dobbeltemulsjonsdråper med utstående oktanollommer. Når lipid-dobbeltlaget samles ved dråpegrensesnittet, løsner lommen spontant for å gi opphav til et unilamellært liposom som er klar for videre manipulering og eksperimentering. OLA gir flere fordeler, for eksempel jevn liposomgenerering (>10 Hz), effektiv innkapsling av biomaterialer og monodispergerte liposompopulasjoner, og krever svært små prøvevolumer (~ 50 μL), noe som kan være avgjørende når du arbeider med dyrebare biologiske. Studien inkluderer detaljer om mikrofabrikasjon, myklitografi og overflatepassivering, som er nødvendig for å etablere OLA-teknologi i laboratoriet. En proof-of-principle syntetisk biologi anvendelse er også vist ved å indusere dannelsen av biomolekylære kondensater inne i liposomene via transmembran protonfluks. Det forventes at denne medfølgende videoprotokollen vil gjøre det lettere for leserne å etablere og feilsøke OLA i laboratoriene sine.
Alle celler har en plasmamembran som deres fysiske grense, og denne membranen er i hovedsak et stillas i form av et lipid-dobbeltlag dannet ved selvmontering av amfifile lipidmolekyler. Liposomer er de minimale syntetiske motstykkene til biologiske celler; De har et vandig lumen omgitt av fosfolipider, som danner et lipid-dobbeltlag med de hydrofile hodegruppene som vender mot den vandige fase og de hydrofobe haler begravet innover. Liposomenes stabilitet styres av den hydrofobe effekten, samt hydrofiliteten mellom polargruppene, van der Waals-kreftene mellom de hydrofobe karbonhalene og hydrogenbindingen mellom vannmolekyler og de hydrofile hodene 1,2. Avhengig av antall lipid-dobbeltlag kan liposomer klassifiseres i to hovedkategorier, nemlig unilamellære vesikler som består av et enkelt dobbeltlag og multilamellære vesikler konstruert fra flere dobbeltlag. Unilamellære vesikler klassifiseres videre basert på deres størrelser. Vanligvis sfæriske i form, kan de produseres i en rekke størrelser, inkludert små unilamellære vesikler (SUV, 30-100 nm diameter), store unilamellære vesikler (LUV, 100-1,000 nm diameter), og til slutt, gigantiske unilamellære vesikler (GUV, >1,000 nm diameter) 3,4. Ulike teknikker har blitt utviklet for å produsere liposomer, og disse kan kategoriseres bredt i bulkteknikker5 og mikrofluidiske teknikker6. Vanlige praktiserte bulkteknikker inkluderer lipidfilmrehydrering, elektroformasjon, invertert emulsjonsoverføring og ekstrudering 7,8,9,10. Disse teknikkene er relativt enkle og effektive, og disse er de viktigste årsakene til deres utbredt bruk i det syntetiske biologisamfunnet. Imidlertid lider de samtidig av store ulemper med hensyn til polydispersiteten i størrelse, mangelen på kontroll over lamellariteten og lav innkapslingseffektivitet 7,11. Teknikker som kontinuerlig dråpegrensesnittkryssende innkapsling (cDICE)12 og dråpeskyting og størrelsesfiltrering (DSSF)13 overvinner til en viss grad disse begrensningene.
Mikrofluidiske tilnærminger har blitt fremtredende i løpet av det siste tiåret. Mikrofluidisk teknologi gir et kontrollerbart miljø for å manipulere væskestrømmer innenfor brukerdefinerte mikrokanaler på grunn av den karakteristiske laminær strømning og diffusjonsdominert masseoverføring. De resulterende lab-on-a-chip-enhetene gir unike muligheter for spatiotemporal kontroll av molekyler, med betydelig reduserte prøvevolumer og multipleksingsevner14. Tallrike mikrofluidiske metoder for å lage liposomer har blitt utviklet, inkludert pulserende jetting 15, dobbel emulsjon templating 16, forbigående membranutstøting 17, dråpeemulsjonsoverføring18 og hydrodynamisk fokusering 19. Disse teknikkene produserer monodispergerte, unilamellar, liposomer i cellestørrelse med høy innkapslingseffektivitet og høy gjennomstrømning.
Denne artikkelen beskriver prosedyren for oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk metode på brikken basert på den hydrodynamiske klemmemekanismen og påfølgende løsningsmiddelavfuktingsmekanisme20 (figur 1). Man kan relatere arbeidet med OLA til en bobleblåsingsprosess. Et seksveis kryss fokuserer den indre vandige (IA) fasen, to lipidbærende organiske (LO) strømmer og to overflateaktivt middelholdige ytre vandige (OA) strømmer på et enkelt sted. Dette resulterer i vann-i-(lipider + oktanol)-i-vann doble emulsjonsdråper. Når disse dråpene strømmer nedstrøms, fører grenseflateenergiminimering, ekstern skjærstrøm og interaksjon med kanalveggene til dannelsen av et lipiddobbeltlag ved grensesnittet når løsningsmiddellommen løsner og danner dermed unilamellære liposomer. Avhengig av størrelsen på oktanollommen, kan dewetting-prosessen ta titalls sekunder til et par minutter. På slutten av utgangskanalen flyter de mindre tette oktanoldråpene til overflaten, mens de tyngre liposomene (på grunn av en tettere innkapslet løsning) synker til bunnen av visualiseringskammeret klar for eksperimentering. Som et representativt eksperiment demonstreres prosessen med væske-væskefaseseparasjon (LLPS) inne i liposomer. For det er de nødvendige komponentene innkapslet i liposomer ved en sur pH som forhindrer LLPS. Ved eksternt å utløse en pH-endring og dermed en transmembran protonfluks, dannes faseseparerte kondensatdråper inne i liposomene. Dette fremhever de effektive innkapslings- og manipuleringsfunksjonene til OLA-systemet.
Cellulær kompleksitet gjør det ekstremt vanskelig å forstå levende celler når de studeres som en helhet. Å redusere redundans og sammenkobling av celler ved å rekonstituere nøkkelkomponentene in vitro er nødvendig for å fremme vår forståelse av biologiske systemer og skape kunstige cellulære etterligninger for bioteknologiske applikasjoner22,23,24. Liposomer fungerer som et utmerket minimalt system for å forstå ce…
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne Dolf Weijers, Vera Gorelova og Roosjen for vennlig å gi oss YFP. SD anerkjenner økonomisk støtte fra det nederlandske forskningsrådet (tilskuddsnummer: OCENW. KLEIN.465).
1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
UV laser | 365 nm wavelength |