On-Chip oktanolassistert liposommontering for bioteknologi

Summary

Den nåværende protokollen beskriver oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk teknikk for å generere biokompatible liposomer. OLA produserer monodispergerte liposomer i mikronstørrelse med effektiv innkapsling, noe som muliggjør umiddelbar eksperimentering på brikken. Denne protokollen forventes å være spesielt egnet for syntetisk biologi og syntetisk celleforskning.

Abstract

Mikrofluidikk er et mye brukt verktøy for å generere dråper og vesikler av forskjellige slag på en kontrollert og høy gjennomstrømningsmåte. Liposomer er forenklede cellulære etterligninger sammensatt av et vandig interiør omgitt av et lipid-dobbeltlag; De er verdifulle i utformingen av syntetiske celler og forstå grunnleggende biologiske celler in vitro mote og er viktige for anvendt vitenskap, for eksempel lastlevering for terapeutiske applikasjoner. Denne artikkelen beskriver en detaljert arbeidsprotokoll for en on-chip mikrofluidisk teknikk, oktanolassistert liposommontering (OLA), for å produsere monodispergerte, mikronstore, biokompatible liposomer. OLA fungerer på samme måte som bobleblåsing, hvor en indre vandig (IA) fase og en omkringliggende lipidbærende 1-oktanolfase klemmes av av overflateaktive ytre væskestrømmer. Dette genererer lett dobbeltemulsjonsdråper med utstående oktanollommer. Når lipid-dobbeltlaget samles ved dråpegrensesnittet, løsner lommen spontant for å gi opphav til et unilamellært liposom som er klar for videre manipulering og eksperimentering. OLA gir flere fordeler, for eksempel jevn liposomgenerering (>10 Hz), effektiv innkapsling av biomaterialer og monodispergerte liposompopulasjoner, og krever svært små prøvevolumer (~ 50 μL), noe som kan være avgjørende når du arbeider med dyrebare biologiske. Studien inkluderer detaljer om mikrofabrikasjon, myklitografi og overflatepassivering, som er nødvendig for å etablere OLA-teknologi i laboratoriet. En proof-of-principle syntetisk biologi anvendelse er også vist ved å indusere dannelsen av biomolekylære kondensater inne i liposomene via transmembran protonfluks. Det forventes at denne medfølgende videoprotokollen vil gjøre det lettere for leserne å etablere og feilsøke OLA i laboratoriene sine.

Introduction

Alle celler har en plasmamembran som deres fysiske grense, og denne membranen er i hovedsak et stillas i form av et lipid-dobbeltlag dannet ved selvmontering av amfifile lipidmolekyler. Liposomer er de minimale syntetiske motstykkene til biologiske celler; De har et vandig lumen omgitt av fosfolipider, som danner et lipid-dobbeltlag med de hydrofile hodegruppene som vender mot den vandige fase og de hydrofobe haler begravet innover. Liposomenes stabilitet styres av den hydrofobe effekten, samt hydrofiliteten mellom polargruppene, van der Waals-kreftene mellom de hydrofobe karbonhalene og hydrogenbindingen mellom vannmolekyler og de hydrofile hodene ^1,2. Avhengig av antall lipid-dobbeltlag kan liposomer klassifiseres i to hovedkategorier, nemlig unilamellære vesikler som består av et enkelt dobbeltlag og multilamellære vesikler konstruert fra flere dobbeltlag. Unilamellære vesikler klassifiseres videre basert på deres størrelser. Vanligvis sfæriske i form, kan de produseres i en rekke størrelser, inkludert små unilamellære vesikler (SUV, 30-100 nm diameter), store unilamellære vesikler (LUV, 100-1,000 nm diameter), og til slutt, gigantiske unilamellære vesikler (GUV, >1,000 nm diameter) ^3,4. Ulike teknikker har blitt utviklet for å produsere liposomer, og disse kan kategoriseres bredt i bulkteknikker⁵ og mikrofluidiske teknikker⁶. Vanlige praktiserte bulkteknikker inkluderer lipidfilmrehydrering, elektroformasjon, invertert emulsjonsoverføring og ekstrudering 7,8,9,10. Disse teknikkene er relativt enkle og effektive, og disse er de viktigste årsakene til deres utbredt bruk i det syntetiske biologisamfunnet. Imidlertid lider de samtidig av store ulemper med hensyn til polydispersiteten i størrelse, mangelen på kontroll over lamellariteten og lav innkapslingseffektivitet ^7,11. Teknikker som kontinuerlig dråpegrensesnittkryssende innkapsling (cDICE)¹² og dråpeskyting og størrelsesfiltrering (DSSF)¹³ overvinner til en viss grad disse begrensningene.

Mikrofluidiske tilnærminger har blitt fremtredende i løpet av det siste tiåret. Mikrofluidisk teknologi gir et kontrollerbart miljø for å manipulere væskestrømmer innenfor brukerdefinerte mikrokanaler på grunn av den karakteristiske laminær strømning og diffusjonsdominert masseoverføring. De resulterende lab-on-a-chip-enhetene gir unike muligheter for spatiotemporal kontroll av molekyler, med betydelig reduserte prøvevolumer og multipleksingsevner¹⁴. Tallrike mikrofluidiske metoder for å lage liposomer har blitt utviklet, inkludert pulserende jetting 15, dobbel emulsjon templating 16, forbigående membranutstøting 17, dråpeemulsjonsoverføring¹⁸ og hydrodynamisk fokusering ¹⁹. Disse teknikkene produserer monodispergerte, unilamellar, liposomer i cellestørrelse med høy innkapslingseffektivitet og høy gjennomstrømning.

Denne artikkelen beskriver prosedyren for oktanolassistert liposommontering (OLA), en mikrofluidisk metode på brikken basert på den hydrodynamiske klemmemekanismen og påfølgende løsningsmiddelavfuktingsmekanisme²⁰ (figur 1). Man kan relatere arbeidet med OLA til en bobleblåsingsprosess. Et seksveis kryss fokuserer den indre vandige (IA) fasen, to lipidbærende organiske (LO) strømmer og to overflateaktivt middelholdige ytre vandige (OA) strømmer på et enkelt sted. Dette resulterer i vann-i-(lipider + oktanol)-i-vann doble emulsjonsdråper. Når disse dråpene strømmer nedstrøms, fører grenseflateenergiminimering, ekstern skjærstrøm og interaksjon med kanalveggene til dannelsen av et lipiddobbeltlag ved grensesnittet når løsningsmiddellommen løsner og danner dermed unilamellære liposomer. Avhengig av størrelsen på oktanollommen, kan dewetting-prosessen ta titalls sekunder til et par minutter. På slutten av utgangskanalen flyter de mindre tette oktanoldråpene til overflaten, mens de tyngre liposomene (på grunn av en tettere innkapslet løsning) synker til bunnen av visualiseringskammeret klar for eksperimentering. Som et representativt eksperiment demonstreres prosessen med væske-væskefaseseparasjon (LLPS) inne i liposomer. For det er de nødvendige komponentene innkapslet i liposomer ved en sur pH som forhindrer LLPS. Ved eksternt å utløse en pH-endring og dermed en transmembran protonfluks, dannes faseseparerte kondensatdråper inne i liposomene. Dette fremhever de effektive innkapslings- og manipuleringsfunksjonene til OLA-systemet.

Protocol

1. Fremstilling av masterwaferen Ta en 4 tommer (10 cm) diameter ren silisiumskive (se materialfortegnelse). Rengjør den ytterligere med trykkluft for å fjerne støvpartikler. Monter skiven på en rotasjonsfrakk, og dispenser forsiktig ~ 5 ml av en negativ fotoresist (se materialfortegnelse) i midten av skiven. Prøv å unngå luftbobler, da de kan forstyrre nedstrøms utskriftsprosessen til skiven. For å oppnå et 10 μm tykt fotoresistl…

Representative Results

Denne studien demonstrerer dannelsen av membranløse kondensater via prosessen med væske-væskefaseseparasjon (LLPS) inne i liposomer som et representativt eksperiment. Prøve forberedelseIA, OA, ES og fôrløsning (FS) fremstilles som følger: IA: 12 % glyserol, 5 mM dekstran, 150 mM KCl, 5 mg/ml poly-L-lysin (PLL), 0,05 mg/ml poly-L-lysin-FITC-merket (PLL-FITC), 8 mM adenosintrifosfat (ATP), 15 mM citrat-HCl (pH 4) <p class="jove…

Discussion

Cellulær kompleksitet gjør det ekstremt vanskelig å forstå levende celler når de studeres som en helhet. Å redusere redundans og sammenkobling av celler ved å rekonstituere nøkkelkomponentene in vitro er nødvendig for å fremme vår forståelse av biologiske systemer og skape kunstige cellulære etterligninger for bioteknologiske applikasjoner^22,23,24. Liposomer fungerer som et utmerket minimalt system for å forstå ce…

Materials

1-Octanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tubes	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biopsy punch	Darwin microfluidics	PT-T983-05	0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Baby	setup and software
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Glass cover slip	Corning	#1, 24 x 40 mm
Glycerol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hydrochloric acid	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU:810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Micro resist technology GmbH	EpoCore 10
Photoresist developer	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G
Polydimethylsiloxane	Dow	Sylgard 184	PDMS and curing agent
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polyvinyl alcohol	Sigma-Aldrich	no. P8136	molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller	Elveflow	OBK1 Mk3+	Flow controller
Scotch tape	Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer	Silicon Materials	0620R16002
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers	Darwin microfluidics	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon tubing	Darwin microfluidics	1/16" OD x 0.02" ID
UV laser			365 nm wavelength