Kryo-STEM-tomografi ger ett sätt att visualisera organeller av intakta celler utan inbäddning, sektionering eller andra invasiva preparat. Den erhållna 3D-upplösningen ligger för närvarande i intervallet några nanometer, med ett synfält på flera mikrometer och en tillgänglig tjocklek i storleksordningen 1 μm.
Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) bygger på avbildning av biologiska eller organiska prover inbäddade i deras ursprungliga vattenhaltiga medium; Vatten stelnar till ett glas (dvs förglasat) utan kristallisation. Kryo-EM-metoden används ofta för att bestämma strukturen hos biologiska makromolekyler nyligen med en nära atomär upplösning. Tillvägagångssättet har utvidgats till studier av organeller och celler med hjälp av tomografi, men det konventionella sättet för EM-avbildning med brett fält lider av en allvarlig begränsning i provtjockleken. Detta har lett till en praxis att fräsa tunna lameller med hjälp av en fokuserad jonstråle; Den höga upplösningen erhålls genom subtomogram medelvärde från rekonstruktionerna, men tredimensionella relationer utanför det återstående skiktet går förlorade. Tjockleksbegränsningen kan kringgås genom skannad sondavbildning, liknande skannings-EM eller det konfokala laserskanningsmikroskopet. Medan skanningstransmissionselektronmikroskopi (STEM) i materialvetenskap ger atomupplösning i enstaka bilder, kräver känsligheten hos kryogena biologiska prover för elektronbestrålning särskilda överväganden. Detta protokoll presenterar en inställning för kryo-tomografi med STEM. Den grundläggande topikala konfigurationen av mikroskopet beskrivs för både två- och trekondensorsystem, medan automatisering tillhandahålls av den icke-kommersiella SerialEM-programvaran. Förbättringar för batchförvärv och korrelativ anpassning till tidigare förvärvade fluorescenskartor beskrivs också. Som ett exempel visar vi rekonstruktionen av en mitokondrion, pekar ut det inre och yttre membranet och kalciumfosfatgranulerna, såväl som omgivande mikrotubuli, aktinfilament och ribosomer. Kryo-STEM-tomografi utmärker sig i att avslöja organellteatern i cytoplasman och i vissa fall till och med kärnperiferin hos vidhäftande celler i odling.
Tredimensionell (3D) visualisering av organeller är en viktig uppgift i modern cellbiologi. Med tanke på de involverade skalorna, allt från tiotals nanometer för sekretoriska vesiklar till många mikron för cellkärnan, är det utmanande att hitta en enda mikroskopiteknik som passar alla applikationer. Medan modern fluorescensmikroskopi kan spänna över mycket av intervallet när det gäller upplösning, visas endast de märkta molekylerna. Den cellulära teatern förblir sfären av elektronmikroskopi. Konventionella metoder för kemisk fixering, plastinbäddning och färgning med tungmetaller är starkt invasiva, så resultaten kan bero på detaljerna i provberedningen. Cryo-EM, å andra sidan, begränsas av behovet av att förglasa det vattenhaltiga mediet; Iskristaller som bildas diffrakterar elektronbelysningen, vilket orsakar kontrastartefakter med högre kontrast än det organiska materialet av intresse.
Det senaste decenniet har sett en spridning av EM-avbildningstekniker utvecklade eller anpassade för cellulära studier1. Högtrycksfrysning i kombination med iterativ fokuserad jonstråle (FIB) fräsning och seriell ytavbildning med svepelektronmikroskopet (dvs. FIB-SEM) är för närvarande den valda metoden för stora prover2. Kryogen mjuk röntgentomografi (kryo-SXT) är lämplig för prover av flera mikron i storlek, begränsad av den karakteristiska absorptionslängden för de mjuka röntgenstrålarna i vatten 3,4,5. Denna skala innehåller många intakta celltyper, och den kvantitativa karaktären hos röntgenabsorptionskontrasten lägger till en aspekt av koncentrationsmätning6 eller spektroskopi7. I kombination med subtomogrammedelvärde erbjuder kryotransmissionselektrontomografi (kryo-ET), baserat på faskontrasttransmissionselektronmikroskopi (TEM), den högsta upplösningen för makromolekyler eller komplex 8,9,10. Det är emellertid sällsynt att intakta organeller är så regelbundna att de i genomsnitt kan hela. Dessutom är det konventionella läget för bredfälts TEM begränsat för provtjocklek till några hundra nanometer genom kombinationen av oelastisk spridning (med energiförlust) i provet och kromatisk aberration i den magnetiska objektivlinsen11,12. Den stora energispridningen dikterar användningen av ett energifilter för att avlägsna den resulterande diset utanför fokus, men det känsliga provet lider fortfarande av strålningsskador medan bildsignalen blir exponentiellt svagare med ökande tjocklek.
Det alternativa avbildningsläget, skanningsöverföring EM (STEM), kringgår behovet av energifiltrering och behåller de oelastiskt spridda elektronerna för bildbildning, om än för närvarande med en lägre upplösning än för TEM-tomografi (figur 1). Faktum är att ingen riktig bild bildas. Istället, som i en skannings-EM, görs mätningar punkt för punkt, och bilden monteras av datorn. Förstoringen bestäms endast av skanningsstegens storlek utan att ändra linsströmmarna. När den är korrekt konfigurerad kan det användbara intervallet för provtjocklek för kryo-STEM-tomografi (CSTET) nå 1,5 eller till och med 2 μm, även om komfortzonen, där den användbara signalintensiteten förblir en betydande del av belysningen, är cirka 600-900 nm11,13. Detta är tillräckligt för att se en stor del av cytoplasman, och ibland en kant av cellkärnan. I praktiken finner vi att vitrifiering med standardmetoden att kasta sig i kryogen vätska medför en allvarligare begränsning av tjockleken än STEM-avbildning. Målet med denna videoartikel är att underlätta införlivandet av CSTET i verktygskistan för cell- och organellavbildning i forskningslaboratorier och mikroskopianläggningar.
Den första utmaningen är att mikroskopoperationer i CSTET ännu inte är standardiserade för life science-tillämpningar på samma sätt som de har varit för kryo-TEM-tomografi. STEM-hårdvara har sällan (om någonsin) riktats mot kryo-EM-marknaden. Detta förändras dock med den senaste generationen mikroskop, och många befintliga verktyg kan eftermonteras. STEM som teknik har tagit fart och till stor del tagit över inom materialvetenskapen, där det också finns ett spirande intresse för kryogena och lågdosmetoder14,15. Materialvetenskaplig litteratur vimlar av akronymer BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, etc., vilket bidrar till förvirringen. Vi erbjuder här en rekommenderad utgångspunkt som, i vår kollektiva erfarenhet vid Weizmann Institute of Science, ger det mest allmänna protokollet för användbara resultat baserat på ljusfält (BF) STEM-avbildning16. Det uttömmer eller utforskar inte på något sätt utbudet av möjligheter, men det kommer att tjäna som grund för ytterligare förbättringar. Medan vi betonar kryo-STEM, är det mesta av protokollet lika relevant för rumstemperatur STEM-tomografi av plastinbäddade sektioner.
Kärnan i STEM är att skanna provet med en fokuserad elektronsond (figur 1), belysningskonen och att spela in signaler från diffraktionsplanet (spridningsplanet) i överföring, pixel för pixel, för att producera 2D-bilder17,18. Amorfa prover, inklusive de flesta cellulära material, kommer att producera ett diffust spridningsmönster vid överföring. Den enklaste praktiska STEM-konfigurationen är att placera en cirkulär detektor för att spela in den centrala skivan (dvs. sondbelysningen som skulle överföras utan prov). Provet sprider elektroner bort från denna belysningskon i den utsträckning att signalen minskar. Detta ger en BF-bild – provet verkar mörkt på en ljus bakgrund. En ringformig detektor kan också (eller istället) användas för att detektera spridningen från provet utanför belysningskonen. Med provet borttaget finns det ingen signal. När ett exemplar är på plats ser objekten ljusa ut på en mörk bakgrund i bilden med mörkt fält (DF). Nomenklaturen för STEM (BF, ringformigt mörkfält [ADF], högvinkelringformigt mörkfält [HAADF], etc.) avser huvudsakligen uppsamlingsvinklarna för detektorerna.
Belysningens konvergensvinkel representerar en väsentlig anpassning av STEM till cellulär tomografi. När högsta prioritet är hög upplösning bör konvergensvinkeln vara så stor som möjligt. (Detta liknar konfokal laserskanningsmikroskopi; upplösningen bestäms av sonddiametern, som skalas som våglängden dividerad med den numeriska bländaren. Observera att vi hänvisar till halvvinkeln eller halvkonvergensvinkeln för EM.) När prioriteten är skärpedjupet, å andra sidan, ger en kompromiss i upplösning en stor fördel, eftersom den fokuserade strålen förblir ungefär parallell för ett avstånd som är lika med dubbelt så stor våglängd dividerat med halvvinkel i kvadrat. Helst förblir hela cellvolymen i fokus19. Till exempel, vid 300 keV är elektrondeBroglie-våglängden 0, 002 nm, så en konvergens på 1 mrad ger en upplösning på 2 nm och ett skärpedjup på 4 mikron. Under dessa förhållanden kan tomografi utföras även utan att fokusera under datainsamlingsprocessen, men endast en gång i början av förvärvet. En konventionell tomografikapabel STEM kan nå en halvkonvergensvinkel på 7 eller 8 mrad; Därför kunde vi i princip nå en upplösning i storleksordningen 0.25 nm, men då med ett brännvidd på endast 62 nm. Detta är helt klart för tunt för cellulär avbildning. Mer avancerade mikroskop med tre kondensorlinser erbjuder kontinuerlig justering av halvkonvergensvinkeln över ett betydande område. Med den mer traditionella tvåkondensorkonfigurationen fixeras konvergensen diskret av kondensorns (C2) bländare.
För robusta, plastinbäddade prover kan man spela in en fokalserie vid varje lutning och kombinera dem för hög upplösning20, men för kryogena prover är strålningsbudgeten för hårt begränsad. Slutligen, vid vägning av fördelarna med BF- eller DF-avbildning, för tjocka prover, bör man överväga effekterna av multipel elastisk spridning i provet. BF-signalen är mindre skadad av multipel spridning och visar en högre upplösning för tjocka exemplar 16,21.
En användbar tumregel har varit att ställa in insamlingsvinklar som är flera gånger större än konvergensen. Ju tjockare provet desto större bör uppsamlingsskivan vara. För liten skiva ger en låg signalintensitet; En för stor disk resulterar i dålig bildkontrast, eftersom endast spridning med högsta vinkel bidrar. Uppsamlingsvinklarna bör optimeras för ett givet prov. Detektorvinklarna som en funktion av kamerans (diffraktion) längd måste kalibreras oberoende av varandra. De kan visas bekvämt av mikroskopprogramvaran. I praktiken är en faktor på två till fem i förhållandet mellan insamling och belysningshalvvinklar, θ respektive α (figur 1), en rekommenderad utgångspunkt för CSTET av cellulära prover.
Följande protokoll beskriver STEM-tomografioperation med den populära SerialEM-programvaran för mikroskopkontroll22,23. SerialEM är inte knutet till en specifik tillverkare, och det används ofta i TEM-tomografi. De flesta operationer vid inrättning för tomografi kan överföras direkt från TEM. SerialEM-strategin är att modellera skanningssystemet som en kamera. Detta möjliggör enkel övergång från TEM till STEM. Man bör dock komma ihåg att parametrar som förstoring och binning är helt artificiella. De viktiga parametrarna är synfältet i mikron, antalet pixlar i synfältet och exponeringstiden. Pixelavståndet, eller samplingen, är det linjära fältet dividerat med antalet pixlar, medan uppehållstiden är antalet pixlar dividerat med exponeringstiden.
Minsta konfiguration för STEM och CSTET innefattar tre funktioner i mikroskopet: en skanningsgenerator, en STEM-detektor och tomografikontrollprogramvara. Protokollet hänvisar till nomenklaturen för FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), men begreppen är generiska. Den proprietära programvaran för TFS har beskrivits i JoVE för TEM24, och STEM-operationen är mycket lika.
Vi antar att mikroskopet har justerats i förväg av serviceteamet eller erfaren personal och att en kolumnjustering kan hämtas genom att ladda en fil. Mindre justeringar kallas direktjusteringar och kan lagras i så kallade FEG-register (TFS-mikroskop). Direkta justeringar inkluderar rotationscentrum, pivotpunkter, diffraktionsjustering och kompensation för kondensatorastigmatism. Justeringar måste utföras iterativt. Observera att TFS-mikroskop implementerar distinkta nanosond (nP) och mikrosond (μP) lägen; För en given kondensoröppning ger dessa ett relativt smalt eller brett synfält med parallell belysning i TEM respektive en mer eller mindre konvergent (tätt fokuserad) elektronstråle i STEM. Andra tillverkare använder andra system för att täcka konvergensvinklarna.
Innan du börjar bör synfältet, L och provtagningen (pixelbredd), l, väljas, beroende på provet som studeras. Till exempel, för l = 1 nm / pixel, bör en 4 000 x 4 000 pixelbild som täcker ett synfält 4 μm2 väljas. Upplösningen kommer i bästa fall att vara dubbelt så stor som den rumsliga provtagningen, så 2 nm, och sonddiametern, d, bör matcha det. Kalibrering av sondvinkeln ligger utanför ramen för detta protokoll, så vi antar att en tabell eller en skärmläsning är tillgänglig. Sondens diameter är ungefär elektronvåglängden dividerad med halvkonvergensvinkeln (i radianer): d = λ / θ. Våglängden, λ, är 0,002 nm för 300 keV och 0,0025 nm för 200 keV-elektroner, så θ på 1 mrad ger en spotdiameter på 2 respektive 2,5 nm.
Protokollet presenteras i en progression av ökande komplexitet. Den första uppgiften är att producera en STEM-bild, som beror på mikroskoptillverkarens programvara, och sedan en lutningsserie, för vilken vi använder SerialEM. Många läsare kommer utan tvekan att känna till SerialEM, så de mer komplicerade uppgifterna kommer naturligt. Det finns ingen anledning att följa förfarandena strikt. Utveckling som rör automatisering kan genomföras direkt för STEM såväl som för TEM. Erfarna användare kommer sannolikt att invertera protokollet, som börjar med korrelativ registrering av fluorescenskartor och fortsätter att ställa in batchtomografi. Mer information finns i de omfattande dokumentations- och handledningsbiblioteken för själva SerialEM, inklusive en ny JoVE-artikel om den senaste utvecklingen inom automation25.
Protokollet ska hjälpa biovetenskapliga mikroskopister som är intresserade av att få en 3D-vy av intracellulära organeller i områden i cellen som inte är tillgängliga för konventionell TEM-tomografi. Samma protokoll kan också användas för STEM-tomografi av plastsnitt, med mildrade begränsningar för exponeringen. Protokollet bör betraktas som en utgångspunkt snarare än en uppsättning hårda regler. Faktum är att kraften i STEM är dess flexibilitet; Det finns inget rätt sätt att använda det.
Vi betonar att STEM i sig endast hänvisar till den skannade sonden och inte definierar bildbildningen. Kontrast beror främst på konfigurationen av detektorer. De enklare metoderna använder detektorer med axiell symmetri, antingen en skiva centrerad på den optiska axeln eller en ringformad som omger den. I allmänhet, när belysningen träffar detektorn direkt, spelar vi in en BF-bild där (elektronspridning) provet verkar mörkt; omvänt, när detektorn bara samlar spridda elektroner, registrerar vi en DF-bild där det täta provet verkar ljust. När lämplig hårdvara finns tillgänglig kan SerialEM hämta och spela in båda dessa signaler samtidigt. Ännu mer sofistikerade konfigurationer finns tillgängliga, allt från detektorer med flera segment till helt pixelerade kameror. Faskontrastavbildning kan uppnås till exempel genom att utvärdera skillnaden mellan off-axis detektorelement32,33. Att samla in hela 2D-spridningsmönstret (diffraktion) per pixel definierar metoden som kallas 4D STEM34, vilket möjliggör rekonstruktion av flera bildkontraster från samma originaldata. Fyrdimensionell STEM möjliggör elektronptykografi, vilket ger ett annat sätt att erhålla faskontrast35.
Vi har fokuserat på den speciella STEM-modalitet som vi anser vara mest användbar för studier av organeller och intakta celler eller mikrontjocka cellsektioner. Detta innebär specifikt användning av BF-avbildning med en liten halvkonvergensvinkel i belysningen och en relativt stor uppsamlingsvinkel vid detektorn. Den lilla konvergensen ger ett stort skärpedjup så att hela provet förblir i fokus genom hela lutningsserien19. I praktiken, med ett bra mikroskopsteg, kan det också eliminera behovet av fokusjustering under förvärvet. Priset är en kompromiss i upplösning, som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet. Vi har föreslagit 4k-bilder med en sond på ~ 2 nm, som med 1 nm pixelavstånd når ett synfält på 4 μm. Läsaren uppmanas dock starkt att experimentera. Det andra övervägandet är på sidan av detektorn. När belysningsskivan underfyller BF-detektorn på axeln undertrycks faskontrasten och spridningskontrasten (amplituden) dominerar; Detta tillstånd har kallats osammanhängande ljusfältkontrast36. Frågan är med vilken fraktion som ska fyllas på, och svaret beror på provet. Ett mycket tunt prov visar bäst kontrast med detektorn helt fylld (dvs. uppsamlingsvinkeln som matchar belysningens), men ett tjockare prov sprider bort all intensitet och lämnar en bullrig signal med dålig kontrast. En användbar tumregel är att ju tjockare provet är, desto större bör BF-detektorns yttre avskärningsvinkel vara21. Detektorns storlek och position är naturligtvis fasta, så diffraktionsskivans storlek justeras med hjälp av kameralängden, som beskrivs i avsnitt 1. Om detektorförstärkarens inställningar är sådana att signalen fyller det dynamiska området men inte mättas under direkt belysning (1.12.3), kan kamerans längd ökas tills en rimlig signalintensitet och kontrast uppnås. Återigen uppmuntras läsaren att experimentera. Konsten är så att säga i vinklarna.
En annan parameter, som inte diskuteras i protokollet, är mikroskopaccelerationsspänningen. Interaktionen mellan de lysande elektronerna och provet blir starkare vid en lägre spänning. Med allt annat lika kan vi förvänta oss högre kontrast vid lägre spänning. Å andra sidan är det uppkomsten av multipel spridning inom provet som begränsar den användbara provtjockleken, så en högre spänning tillåter användning av tjockare prover. Dessa effekter är dock ganska subtila. Våra erfarenheter hittills med 200 kV och 300 kV accelerationer är likartade.
Med tanke på vad som kan förväntas av STEM när det gäller upplösning beror detta återigen på provet och detektorkonfigurationen. Med hjälp av en enda partikelanalysmetod kunde metalljoner på ferritin lokaliseras av ringformigt mörkfält STEM till en precision av några ångström37. På senare tid uppnåddes subnanometerupplösning för virus- och proteinprover med hjälp av bilder erhållna genom integrerad differentialfaskontrast (iDPC) STEM32 samt ptykografi35. För unika föremål i tjocka cellulära prover, och med de metoder som beskrivs här, är en sådan hög upplösning inte realistisk. Den optimala upplösningen är sonddiametern, som relaterar till halvkonvergensvinkeln enligt beskrivningen. Andra faktorer kommer att försämra upplösningen, särskilt en grov pixelprovtagning för att nå ett stort synfält, felinriktningar i lutningsserien och spridning av sondstrålen vid överföring. Bilder jämför bra med plastsektionstomografi. Med den inställning som beskrivs här, till exempel, bör det vara lätt att se den ihåliga kärnan i mikrotubuli, men inte de enskilda protofilamenten.
Sammanfattningsvis är både STEM-metoder och hårdvara i en utvecklingsfas. Vi kan förvänta oss att innovationer inom bildbehandling också kommer att påverka tomografi, vilket leder STEM till domäner som inte har varit tillgängliga med andra tekniker. Vi förväntar oss att en konvergens med korrelativ kryogen fluorescensavbildning baserad på moderna optiska superupplösningsmetoder kommer att vara särskilt fruktbar. Organellskalan, 100-1 000 nm, är ett idealiskt mål för dessa framväxande metoder.
The authors have nothing to disclose.
Vi är oerhört tacksamma för det kontinuerliga och konstanta stödet från författaren och underhållaren av programvarupaketet SerialEM, David Mastronade och Günther Resch. P.K. finansierades av den österrikiska vetenskapsfonden (FWF) genom ett Schrödinger Fellowship J4449-B. För öppen tillgång har författarna tillämpat en CC-BY offentlig upphovsrättslicens för alla författare accepterade manuskriptversioner som härrör från detta bidrag. ME och SGW erkänner finansiering från Israel Science Foundation, bidrag nr 1696/18, och från Europeiska unionens Horizon 2020 Twinning-projekt, ImpaCT (bidrag nr.857203). M.E. erkänner finansiering från ERC i CryoSTEM-projektet (bidrag nr 101055413). ME är innehavare av Sam och Ayala Zacks professorsordförande och chef för Irving och Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging. M.E.s laboratorium har dragit nytta av Harold Perlman-familjens historiska generositet. Vi erkänner också EU:s finansiering. De åsikter som uttrycks är dock författarens/författarnas egna och återspeglar inte nödvändigtvis EU:s eller genomförandeorganet för Europeiska forskningsrådets sida. Varken Europeiska unionen eller den beviljande myndigheten kan hållas ansvariga för dem.
SerialEM | University of Colorado | Veriosn 4.0 | SerialEM is a free software platform for microscope control and data acquisition. |
STEM-capable transmission electron microscope | The protocol was written based on experience with several microscopes of Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica, and Tecnai T20-F. In principle it should be applicable to other manufacturers as well. |