BS3 Chemical Crosslinking Assay: הערכת ההשפעה של לחץ כרוני על פני התא GABAמצגת קולטן במוח מכרסם
Summary
בדיקת הקרוסלינקינג הכימי BS3 חושפת ביטוי קולטן GABAמופחת בפני השטח של התא במוחות עכברים בתנאי לחץ פסיכו-סוציאלי כרוניים.
Abstract
חרדה היא מצב רגשי המשפיע באופן משתנה על התנהגויות בעלי חיים, כולל תפקודים קוגניטיביים. סימנים התנהגותיים של חרדה נצפים ברחבי ממלכת החי וניתן לזהות אותם כתגובות אדפטיביות או לא מסתגלות למגוון רחב של שיטות לחץ. מכרסמים מספקים מודל ניסיוני מוכח למחקרים תרגומיים העוסקים במנגנונים אינטגרטיביים של חרדה ברמה המולקולרית, התאית והמעגלית. בפרט, פרדיגמת הלחץ הפסיכו-סוציאלי הכרוני מעוררת תגובות לא מסתגלות המחקות פנוטיפים התנהגותיים דמויי חרדה/דיכאון המקבילים בין בני אדם למכרסמים. בעוד שמחקרים קודמים הראו השפעות משמעותיות של סטרס כרוני על תכולת המוליכים העצביים במוח, ההשפעה של סטרס על רמות קולטני המוליכים העצביים אינה נחקרת. במאמר זה אנו מציגים שיטה ניסיונית לכימות רמות פני השטח העצביים של קולטני מוליכים עצביים בעכברים תחת לחץ כרוני, במיוחד תוך התמקדות בקולטני חומצה גמא-אמינובוטירית (GABA), אשר מעורבים בוויסות של רגש וקוגניציה. באמצעות שימוש בקרוסלינקר כימי בלתי הפיך בלתי חדיר ממברנה, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), אנו מראים כי לחץ כרוני מפחית באופן משמעותי את זמינות פני השטח של קולטני GABAA בקליפת המוח הקדם-מצחית. רמות פני השטח העצביים של קולטני GABAA הן התהליך המגביל את קצב ההולכה העצבית של GABA ולכן יכולות לשמש כסמן מולקולרי או כייצוג של מידת הפנוטיפים דמויי חרדה/דיכאון במודלים ניסיוניים של בעלי חיים. גישת הצלבה זו ישימה למגוון מערכות קולטנים עבור מוליכים עצביים או נוירומודולטורים המתבטאים בכל אזור במוח וצפויה לתרום להבנה עמוקה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס הרגש והקוגניציה.
Introduction
קולטני מוליכים עצביים ממוקמים על פני השטח של קרום הפלזמה העצבי או באופן תוך-תאי על האנדוממברנות (למשל, האנדוזום, הרשתית האנדופלסמית [ER], או המנגנון הטרנס-גולגי) ונעים באופן דינמי בין שני תאים אלה בהתאם למצבים פיזיולוגיים פנימיים בנוירונים או בתגובה לפעילות חיצונית של הרשת העצבית 1,2. מאחר שמוליכים עצביים חדשים מפרישים את תפקודיהם הפיזיולוגיים בעיקר דרך מאגר הקולטנים המקומי, רמות קולטני פני השטח של מוליך עצבי נתון הן אחד הגורמים הקריטיים ליכולת האיתות שלו בתוך המעגל העצבי3.
קיימות מספר שיטות לניטור רמות קולטני פני השטח בתאי עצב בתרבית, כולל בדיקת ביוטינילציה של פני השטח4, בדיקת אימונופלואורסצנטיות עם נוגדן ספציפי בתנאים שאינם חדירים, או שימוש בטרנסגן קולטן המאוחה גנטית עם אינדיקטור אופטי פלואורסצנטי רגיש ל- pH (למשל, pHluorin)6. לעומת זאת, גישות אלה מוגבלות או לא מעשיות בעת הערכת רמות קולטני פני השטח in vivo. לדוגמה, הליך ביוטינילציה על פני השטח עשוי שלא להיות מעשי לעיבוד כמויות גדולות ומספרי דגימה של רקמות מוח in vivo בשל מחירו הגבוה יחסית והצעדים הבאים הדרושים לטיהור חלבוני הביוטינילציה על חרוזים מצומדים של אבידין. עבור תאי עצב המשובצים בארכיטקטורה תלת-ממדית של המוח, נגישות נמוכה של נוגדנים או קשיים בכימות מבוסס מיקרוסקופ עשויים להוות מגבלה משמעותית להערכת רמות קולטני פני השטח in vivo. כדי להמחיש את התפלגות קולטני המוליכים העצביים במוחות שלמים, ניתן להשתמש בשיטות לא פולשניות, כגון טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים, כדי למדוד את תפוסת הקולטנים ולהעריך את רמות קולטני פני השטח7. עם זאת, גישה זו מסתמכת באופן קריטי על זמינותם של ליגנדות רדיו ספציפיות, ציוד יקר ומומחיות מיוחדת, מה שהופך אותה לפחות נגישה לשימוש שגרתי על ידי רוב החוקרים.
במאמר זה אנו מתארים שיטה פשוטה ורב-תכליתית למדידת רמות קולטני פני השטח במוחות של חיות ניסוי ex vivo באמצעות קרוסלינקר כימי מסיס במים ואטום לקרום, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 מכוון לאמינים ראשוניים בשרשרת הצדדית של שאריות ליזין ויכול להצליב חלבונים באופן קוולנטי בסמיכות זה לזה. כאשר פרוסות מוח מוכנות מאזור מעניין ומודגרות במאגר המכיל BS3, קולטני פני השטח של התא מוצלבים עם חלבונים שכנים, וכך הופכים למינים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר, בעוד שהקולטנים הקשורים לרירית הרחם התוך-תאית נותרים ללא שינוי. לכן, ניתן להפריד את מאגרי הקולטנים הפני השטח והתוך תאיים על ידי אלקטרופורזה של ג’ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) ולכמת על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים לקולטן הנחקר.
עקה כרונית קלה בלתי צפויה (UCMS) היא פרדיגמה ניסיונית מבוססת היטב לגרימת לחץ פסיכו-סוציאלי כרוני במכרסמים10. UCMS מעורר פנוטיפים התנהגותיים דמויי חרדה/דיכאון וליקויים קוגניטיביים באמצעות אפנון של מערך של מערכות נוירוטרנסמיטרים, כולל GABA והקולטנים שלה10,11. בפרט, קולטן GABA A המכיל תת-יחידה α5 (α5-GABAA R) מעורב בוויסות הזיכרון והתפקודים הקוגניטיביים12,13, דבר המצביע על מעורבות אפשרית של תפקודים משתנים של תת-יחידה זו בליקויים קוגניטיביים הנגרמים על ידי UCMS. בפרוטוקול זה, השתמשנו בבדיקת BS3 crosslinking כדי לכמת רמות של α5-GABAAR מבוטא בפני השטח בקליפת המוח הקדם-מצחית של עכברים שנחשפו ל-UCMS בהשוואה לעכברי ביקורת שאינם בסטרס.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שההשפעה של לחץ פסיכו-סוציאלי כרוני על התנהגויות (כלומר, רגשיות וליקויים קוגניטיביים) ושינויים מולקולריים (כלומר, ביטוי מופחת של גנים GABAergic וליקויים נלווים בהולכה עצבית GABAergic) מתועדים היטב10, המנגנונים העומדים בבסיס ליקויים כאלה זקוקים לחקירה נוספת. בפרט, בהתחשב במחקר האח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות מתקן בעלי החיים CAMH על הטיפול בבעלי החיים לאורך כל תקופת המחקר. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), קרן דיסקברי מה-CAMH (ל-T.P.), הברית הלאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (פרס NARSAD #25637 ל-E.S.), ומכון המחקר לבריאות הנפש ע”ש משפחת קמפבל (ל-E.S). א.ס. הוא המייסד של Damona Pharmaceuticals, ביופארמה המוקדשת להבאת תרכובות GABAergic חדשניות למרפאה.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
