Her præsenterer vi en generel metode til bestemmelse af embryonale levedygtighed og det samlede antal embryoner produceret (yngel) ved hjælp af modelorganismen C. elegans.
Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til undersøgelse af meiose, befrugtning og embryonal udvikling. C. elegans eksisterer som selvbefrugtende hermafroditter, der producerer store kuld af afkom – når mænd er til stede, kan de producere endnu større kuld af krydsafkom. Fejl i meiose, befrugtning og embryogenese kan hurtigt vurderes som fænotyper af sterilitet, nedsat fertilitet eller embryonal dødelighed. Denne artikel beskriver en metode til bestemmelse af embryonal levedygtighed og yngelstørrelse i C. elegans. Vi demonstrerer, hvordan man opretter dette assay ved at plukke en orm på en individuel modificeret ynglings, kun Bacto-peptone (MYOB) plade, etablere den passende tidsramme til at tælle levedygtige afkom og ikke-levedygtige embryoner og forklare, hvordan man nøjagtigt tæller levende ormprøver. Denne teknik kan bruges til at bestemme levedygtighed i selvbefrugtende hermafroditter samt krydsbefrugtning ved parringspar. Disse relativt enkle eksperimenter er let anvendelige for nye forskere, såsom bachelorstuderende og førsteårsstuderende.
Seksuel reproduktion i eukaryote organismer kræver produktion af funktionelle gameter, der fusionerer for at danne et embryo gennem befrugtningsprocessen. Moder- og faderlige kønsceller, æg (æg) og sædceller skabes gennem de specialiserede celledelings- og differentieringsprocesser af meiose og gametogenese1. Meiose starter med en enkelt diploide celle og slutter med dannelsen af datterceller, der indeholder halvdelen af antallet af kromosomer i den oprindelige forældrecelle. Fra reduktion af ploidi til blanding af genetisk materiale via uafhængigt sortiment og crossover-rekombination tjener meiose flere vigtige funktioner1. Fejl inden for meiose kan resultere i aneuploidi, hvor der er for mange eller for få kromosomer i en gamet. Forekomster af aneuploidier har enorme konsekvenser for menneskers sundhed, da kromosomale ubalancer er en væsentlig årsag til aborter og udviklingsforstyrrelser som Downs syndrom og Edwards syndrom2.
Befrugtning er den proces, hvorved moderens og faderens gameter smelter sammen for at generere en ny organisme3. Gamete-gametgenkendelse lettes af proteiner på gametoverfladen3. Fejl med gametkompatibilitet fører til infertilitet, da sæd- og ægfusion ikke kan fortsætte. Fusionen af sædceller med en oocyt udløser en lang række begivenheder, der fører til korrekt dannelse af et aktivt embryo, der kan begynde udviklingsrejsen fra et enkeltcelleembryo til en fuldt funktionel flercellet organisme via mitotiske opdelinger4. Gennem embryogenese skal molekylære begivenheder, der regulerer udviklingen, være stramt reguleret og præcist timet for at muliggøre korrekt vækst af organismen5. Korrekt cellulær differentiering under tidlig udvikling er afgørende, da organismen overgår fra et pluripotent embryo til en fuldgyldig organisme. På grund af kompleksiteten af disse begivenheder kan forstyrrelser føre til udviklingsfejl, der resulterer i embryonal dødelighed.
Caenorhabditis elegans er en fremragende modelorganisme til at studere meiose, befrugtning og embryonal udvikling. C. elegans er en gennemsigtig nematode, der har to køn, mænd og hermafroditter. C. elegans hermafroditter, som er i stand til selvbefrugtning, er det dominerende køn 6,7. Hermafroditgonaden producerer først sædceller under det fjerde larvestadium (L4), som opbevares i spermatheca. Ved overgangen fra L4 til voksenalderen skifter kimlinjen til at producere oocytter, som derefter befrugtes via den lagrede sæd. Mænd, der opstår i hermafroditter med en hastighed på mindre end 0,2%, producerer kun sæd og kan parre sig med hermafroditter. Ved krydsbefrugtning udkonkurrerer mandlig sæd hermafroditsæd i befrugtning af oocytter8. Dette giver mulighed for relativt let vedligeholdelse af homozygote mutanter gennem selvbefrugtende bestande og for genetiske manipulationer gennem genetiske krydsninger. De to køn giver mulighed for undersøgelser, der undersøger forskelle mellem meiose i mandlige og kvindelige kimlinjer. På grund af den gennemsigtige karakter af C. elegans og dets æg kan processerne for meiose, gametogenese, befrugtning og embryogenese undersøges hos levende, intakte dyr ved hjælp af fluorescensbilleddannelsesteknikker.
Når man analyserer nye mutationer i gener, der kan spille en rolle i meiose, befrugtning og / eller embryonal udvikling i C. elegans, er et afgørende første skridt at bestemme embryonal levedygtighed og yngelstørrelse, da fejl i disse processer ofte fører til en fiasko eller reduktion i produktionen af levedygtigt afkom. Dette papir beskriver en protokol til vurdering af fertilitet, embryonal levedygtighed og yngelstørrelse fra enten selvbefrugtende hermafroditter eller krydsninger mellem hermafroditter og mænd. Mens dette klassiske assay er blevet brugt i mange C. elegans undersøgelser, leverer vi en standardiseret protokol til opsætning og nøjagtig kvantificering. I denne protokol isoleres individuelle orme eller mandlige / hermafroditpar for at muliggøre parring og afkomproduktion. Afkomsproduktion og levedygtighed observeres over en række dage for at bestemme antallet af levedygtige afkom og ikke-levedygtige embryoner. Ved afslutningen af eksperimentet analyseres individuelle kuld for at beregne embryonale levedygtighedsprocent og total yngelstørrelse.
Formering af seksuelt reproducerende arter kræver dannelse af haploide gameter (dvs. æg og sædceller) gennem meiose, som derefter forenes ved befrugtning, genopretter det diploide kromosomnummer og initierer embryonal udvikling. Fejl i nogen af disse processer kan føre til infertilitet, embryonal dødelighed og / eller fødselsdefekter. C. elegans er et kraftfuldt modelsystem til at studere seksuel reproduktion. Virkningerne af genmutationer eller knockdown af genekspression (f.eks. RNA-interferens) kan vurderes relativt hurtigt og let ved hjælp af de embryonale levedygtigheds- og yngelstørrelsesassays, der er beskrevet ovenfor. Vi har brugt disse metoder til den indledende karakterisering af gener, der er involveret i meiotisk kromosomadskillelse og befrugtning / ægaktivering10,11,12. En observeret reduktion i embryonal levedygtighed eller yngelstørrelse indikerer en forstyrrelse i meiose, gametogenese, befrugtning eller embryogenese.
Da embryonal levedygtighed og yngelstørrelse vurderes relativt let ved at tælle afkom og en simpel matematisk beregning, er disse optimale introduktionseksperimenter for forskningsbegyndere enten i laboratoriet eller klasseværelset. Den lette C. elegans husdyrhold og økonomiske fordele gør dem særligt velegnede til eksperimentel biologi klasser. De studerende får værdifuld forskningserfaring gennem C. elegans husdyrhold, lærer at bruge dissekerende mikroskoper og kan stille biologiske spørgsmål i et udviklingssystem, der kan besvares på relativt kort tid (ca. 5 dage med protokollen beskrevet i dette papir).
Tidspunktet for antallet af afkom er meget vigtigt for analyser af embryonale levedygtighed. Ved 20 °C tager embryogenesen ca. 16 timer, og reproduktivt modne voksne begynder at lægge æg ca. 60 timer efter udklækningen som L1-larver. Da livscyklussen er hurtig, er det vigtigt at tælle afkom inden for det relevante vindue, så embryonerne har tilstrækkelig tid til at klække, men før afkommets eget afkom begynder at lægge æg. Det er også vigtigt at bemærke, at vækstperioder varierer afhængigt af temperaturen. Væksten er ca. 2,1 gange hurtigere ved 24-25 °C end 15-16 °C og ca. 1,3 gange hurtigere ved 20 °C end 15-16 °C13. I denne protokol anbefaler vi, at tællinger sker 48 timer efter, at de voksne er placeret på en frisk tallerken. Denne tidsramme sikrer, at alle embryoner med udvikling af vildtyper har tilstrækkelig tid til at klække (>16 timer), men ikke ældes til det punkt, hvor de er reproduktionsevne. Det kan være nødvendigt at forlænge analyser udført ved temperaturer under 20 °C (overføre dyr i 4 dage), så embryonerne klækkes, og afkommets afkom når larvestadier, der er lettere at observere blandt bakterierne på MYOB-pladerne (L3-L4-stadier).
En begrænsning for embryonale levedygtighedsanalyser og yngelstørrelser er, at den specifikke udviklingsproces, der forstyrres, ikke er umiddelbart synlig. Imidlertid kan disse indledende assays følges op med cytologiske teknikker for at bestemme, hvilken proces der påvirkes. For eksempel kan dissektion af de voksne orme for at frigive gonaden efterfulgt af 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning og omhyggelig analyse af DNA-morfologi inden for kimlinjen afsløre, om meiotiske processer forstyrres. Derudover kan DAPI-farvning af embryoner afsløre, på hvilket stadium embryogenese arresterer.
Afslutningsvis har vi beskrevet en protokol til analyse af antallet af producerede embryoner (yngel) og procentdelen af embryoner, der er levedygtige for forskellige C. elegans-mutanter. Dette assay kan bruges til både selvbefrugtende hermafroditter og til mandlige / hermafrodit krydsninger. Med C. elegans korte livscyklus kan denne protokol afsluttes på mindre end 1 uge. Embryonale levedygtighedsanalyser og yngelstørrelser kan bruges som første analyser af gener, der er involveret i meiose, befrugtning eller embryonal udvikling, og er passende protokoller for mere avancerede forskere og forskningsbegyndere (både bachelor- og førsteårsstuderende).
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet i Jaramillo-Lambert-laboratoriet støttes af National Institutes of Health NIGMS R35GM142524. Alle C. elegans stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som finansieres af National Institutes of Health, P40 OD010440. Figur 1D blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.
Materials | |||
35 mm Petri dishes | Tritech research | T3501 | Semi-stackable, non-vented. |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For MYOB |
Bacto-Peptone | Gibco | 211677 | For MYOB |
Cholestrol | Sigma | C8503 | For MYOB |
Sodium Chloride | J.T. Baker | FW 58.440 | For MYOB |
Trizma Base | Sigma | T1503 | For MYOB |
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | For MYOB |
Strains | |||
C. elegans wild type strain | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | |
Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
him-5(e1490) | Caenorhabditis Genetics Center | DR466 | |
spo-11(ok79) | Caenorhabditis Genetics Center | AV106 | |
Equipment/software | |||
Differential cell counter | Fischer Scientific | 02-670-12 | |
MicroSoft Excel or Prism | MicroSoft or GraphPad | For recording and creating graphical representations of data. | |
platinum wire | Tritech research | PT9901 | For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick). |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.) |
worm pick handle | Tritech research | TWPH1 | For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette. |