यह काम पृथक मस्तिष्क माइक्रोग्लिया में इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके वैश्विक हिस्टोन संशोधनों की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। काम में माइक्रोग्लिया अलगाव प्रोटोकॉल भी शामिल है जिसका उपयोग डेटा संग्रह के लिए किया गया था।
जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण आंशिक रूप से क्रोमैटिन संरचना में संशोधनों द्वारा होता है, जिसमें हिस्टोन पूंछ के लिए पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को जोड़ना और हटाना शामिल है। हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (एचपीटीएम) या तो जीन अभिव्यक्ति या दमन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, हिस्टोन पूंछ लाइसिन अवशेषों का एसिटिलीकरण सकारात्मक चार्ज को बेअसर करता है और पूंछ और नकारात्मक चार्ज डीएनए के बीच बातचीत को कम करता है। हिस्टोन पूंछ-डीएनए इंटरैक्शन में कमी के परिणामस्वरूप अंतर्निहित डीएनए की पहुंच में वृद्धि होती है, जिससे प्रतिलेखन कारक पहुंच में वृद्धि होती है। एसिटिलीकरण चिह्न ब्रोमोडोमेन युक्त ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के लिए एक मान्यता स्थल के रूप में भी कार्य करता है, जिसके परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। हिस्टोन के निशान को सेल भेदभाव के दौरान और विभिन्न सेलुलर वातावरण और उत्तेजनाओं के जवाब में गतिशील रूप से विनियमित किया जा सकता है। जबकि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोणों ने व्यक्तिगत हिस्टोन संशोधनों के लिए जीनोमिक स्थानों को चिह्नित करना शुरू कर दिया है, केवल एक संशोधन की समवर्ती जांच की जा सकती है। यह देखते हुए कि सैकड़ों अलग-अलग एचपीटीएम हैं, हमने वैश्विक एचपीटीएम का एक उच्च थ्रूपुट, मात्रात्मक माप विकसित किया है जिसका उपयोग अधिक व्यापक जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण आयोजित करने से पहले हिस्टोन संशोधनों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल वैश्विक एचपीटीएम का पता लगाने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है और विवो ऊतकों में से संस्कृति या पृथक कोशिकाओं में कोशिकाओं का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है। हम पृथक माउस मस्तिष्क माइक्रोग्लिया से उदाहरण डेटा प्रस्तुत करते हैं ताकि बैक्टीरिया-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा उत्तेजना (लिपोपॉलेसेकेराइड) के जवाब में एचपीटीएम में वैश्विक बदलावों का पता लगाने के लिए परख की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया जा सके। यह प्रोटोकॉल एचपीटीएम के तेजी से और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और इसे किसी भी ट्रांसक्रिप्शनल या एपिजेनेटिक नियामक पर लागू किया जा सकता है जिसे एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जा सकता है।
एपिजेनेटिक्स उन तंत्रों का अध्ययन है जो अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम को बदले बिना जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं। जीन अभिव्यक्ति का एपिजेनेटिक विनियमन कोशिकाओं के भीतर गतिशील है और विभिन्न पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के लिए तेजी से और समन्वित प्रतिक्रियाओं की अनुमति दे सकता है। न्यूक्लियोसोम के स्तर पर क्रोमैटिन संरचना में परिवर्तन के कारण गतिशील विनियमन आंशिक रूप से होता है, जिसमें हिस्टोन प्रोटीन (एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3, एच 4) शामिल होते हैं, जो डीएनए1 द्वारा कसकर घाव किए गए ऑक्टेमर कोर में इकट्ठे होते हैं। हिस्टोन प्रोटीन और डीएनए के बीच की बातचीत प्रतिलेखन मशीनरी के लिए डीएनए की पहुंच को नियंत्रित कर सकती है, जो अंततः जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन जीव विज्ञानके अन्य पहलुओं को नियंत्रित कर सकती है। हिस्टोन प्रोटीन में असंरचित पूंछ होती है जिसमें सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अवशेष होते हैं जो नकारात्मक चार्ज डीएनए रीढ़ के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन बनाते हैं। इन इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप डीएनए की तंग पैकिंग होती है और डीएनए पहुंच कम हो जाती है। हिस्टोन पूंछ के लिए सहसंयोजक संशोधनों, हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (एचपीटीएम) कहा जाता है, इन इंटरैक्शन 3,4 को विनियमित कर सकते हैं। सबसे अच्छी तरह से विशेषता एचपीटीएम में से कुछ में हिस्टोन पूंछ एसिटिलेशन और मिथाइलेशन शामिल हैं, जो हिस्टोन पूंछ और डीएनए के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की आत्मीयता को बदल सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्निहित डीएनए में अंतर पहुंच और प्रतिलेखन कारकों की भर्ती होती है जो विशिष्ट साइटों पर इन एचपीटीएम को पहचानते हैं। एचपीटीएम को एंजाइमों के तीन महत्वपूर्ण वर्गों द्वारा नियंत्रित किया जाता है जिन्हें पाठक कहा जाता है- जो पहचानते हैं, लेखक- जो जमा करते हैं, और इरेज़र- जो एचपीटीएम को हटाते हैं। इस प्रकार, पाठक, लेखक, या इरेज़र एंजाइमों की भर्ती या विघटन अंततः एचपीटीएम के परिदृश्य को बदल सकता है और क्रोमैटिन की संरचना और कार्य को नियंत्रित कर सकता है, जिससे सेलुलर जीव विज्ञान और फ़ंक्शन 3,4 को समझने के लिए उनके विनियमन और रीडआउट आवश्यक हो जाते हैं।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में कोशिकाएं एपिजेनेटिक रूप से लचीली होती हैं क्योंकि वे पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के अनुकूल होने के लिए अपने प्रतिलेख को बदलते हैं। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि डीएनए मेथिलिकरण, गैर-कोडिंग आरएनए और एचपीटीएम जैसे एपिजेनोम में परिवर्तन, स्मृति गठन और सिनैप्टिक फ़ंक्शन5 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। प्रासंगिक पाठकों, लेखकों, या इरेज़र के हेरफेर के माध्यम से एचपीटीएम गतिशीलता को बाधित करना सहयोगी सीखने और दीर्घकालिक पोटेंशिएशन 6,7,8 को अवरुद्ध या बढ़ा सकता है। माइक्रोग्लिया, सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिका, तेजी से उनके epigenome 9,10,11 में गतिशील परिवर्तन के माध्यम से प्रतिरक्षा उत्तेजना के जवाब में उनके प्रतिलेख को विनियमित. उनके स्थानीय मस्तिष्क पर्यावरण के लिए अनुकूलन के इस उच्च स्तर उन्हें मुश्किल एक अलग संदर्भ में जांच करने के लिए बनाता है के रूप में अध्ययनों से पता चला है कि epigenome और microglia के प्रतिलेख मस्तिष्क पर्यावरण11 से हटाने के बाद संस्कृति मीडिया में केवल कुछ ही घंटों के बाद बदल जाता है. इसके अलावा, माइक्रोग्लिया केवल मस्तिष्क की कोशिकाओं का 10% बनाने के रूप में, पूरे ऊतक स्तर पर परिवर्तन की जांच उपायों संवेदनशीलता औरविशिष्टता 12,13 की कमी. नतीजतन, एचपीटीएम स्तर, पूर्व विवो जैसे एपिजेनेटिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए माइक्रोग्लिया को तेजी से अलग करने की आवश्यकता होती है।
एचपीटीएम की जांच करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियों में क्रोमैटिन-इम्यूनोप्रिपिटेशन अनुक्रमण (चिप-सीक्यू) और लक्ष्य और टैगमेंटेशन अनुक्रमण (कट और टैग-सीक्यू) 4 के तहत दरार शामिल हैं। इन तकनीकों एक व्यक्ति एचपीटीएम के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं और एक विशिष्ट जीनोमिक संदर्भ के भीतर एचपीटीएम की उपस्थिति को सूचित कर सकते हैं, वे केवल एक ही प्रयोग11,14 के भीतर कई संभव एचपीटीएम में से एक की जांच कर सकते हैं इसलिए, इस तरह के प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले, जो एक महत्वपूर्ण समय और धन निवेश की आवश्यकता होती है, यह पहले वैश्विक में परिवर्तन की जांच करके आगे की जांच के लिए संभावित दिलचस्प एचपीटीएम की सूची को कम करने के लिए बेहद मूल्यवान है एचपीटीएम के स्तर। वैश्विक एचपीटीएम स्तरों की जांच के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण हैं, लेकिन दोनों दृष्टिकोण केवल अर्ध-मात्रात्मक, कम-थ्रूपुट हैं, और बड़ी संख्या में ऊतक वर्गों या पृथक कोशिकाओं 15,16की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हमने एक अत्यधिक संवेदनशील, मात्रात्मक विधि विकसित करने का लक्ष्य रखा जिसका उपयोग वैश्विक एचपीटीएम स्तरों की तेजी से और एकल कोशिका स्तर पर जांच करने के लिए किया जा सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल इंट्रान्यूक्लियर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके तेजी से वैश्विक एचपीटीएम स्तरों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। कैंसर कोशिकाओं में पिछले अध्ययनों एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य17,18 से वैश्विक स्तर की जांच के महत्व को उचित ठहराया है. यह भी ब्याज19,20 के विशिष्ट एचपीटीएम के जीनोमिक स्थान का आकलन करने से पहले एक स्क्रीनिंग विधि के रूप में वैश्विक स्तर का उपयोग करने के लिए अध्ययन के लिए आम है. माइक्रोग्लिया के लिए, कम सेल उपज के कारण अलगाव के बाद वैश्विक स्तर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण है; पैन एट अल पृथक माइक्रोग्लिया से वैश्विक एचपीटीएम स्तर प्रस्तुत करता है, जिसमें तीन जानवरों से माइक्रोग्लिया को पश्चिमी धब्बा19 द्वारा प्रोटीन स्तर का पता लगाने में सक्षम करने के लिए पूल किया गया था। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम बहुत कम सेल इनपुट के साथ वैश्विक परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम हैं, प्रति जानवर कई अंकों की स्क्रीनिंग को सक्षम करते हैं और नमूनों को पूल करने की आवश्यकता को समाप्त करते हैं।
यहां, हम पृथक माइक्रोग्लिया में मात्रात्मक इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एचपीटीएम के स्तर का तेजी से पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। जबकि हम संक्षिप्तता के लिए एचपीटीएम परिमाणीकरण पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करते हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग पाठक, लेखक और इरेज़र एंजाइमों के वैश्विक स्तर को निर्धारित करने के लिए उसी तरह से किया जा सकता है। प्रोटोकॉल दो भागों में दिया जाता है: पहला, माइक्रोग्लिया के लिए अलगाव विधि और, दूसरा, एचपीटीएम स्तरों को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि। अलगाव विधि कोशिकाओं का उत्पादन करती है जिनका उपयोग आरएनए अलगाव और एचपीटीएम स्तर मूल्यांकन दोनों के लिए किया जा सकता है जो एक ही नमूने से जीन अभिव्यक्ति और एचपीटीएम स्तरों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एचपीटीएम मूल्यांकन के लिए विधि प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में अन्य सेल प्रकार पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से वैश्विक एचपीटीएम स्तरों के मात्रात्मक मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। जबकि इस प्रोटोकॉल एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करता है, पिछले अध्ययनों एक समान दृष्टिकोण26 का उपयोग कर प्रोटीन की मात्रात्मक मूल्यांकन किया है. एचपीटीएम के वैश्विक स्तर का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली विधियों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी धब्बा 16,17,19,20 शामिल हैं। प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि एक आसानी से मात्रात्मक विधि है, जबकि पश्चिमी धब्बा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अर्ध-मात्रात्मक हैं और कम थ्रूपुट हैं। पश्चिमी धब्बा सेल लसीका पर निर्भर करता है और इस प्रकार दोनों प्रोटीन सामान्यीकरण और एक लोड हो रहा है नियंत्रण प्रोटीन है कि प्रयोगात्मक हालत27 द्वारा अपरिवर्तित माना जाता है की आवश्यकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अर्धमात्रात्मक और बहुत कम थ्रूपुट है क्योंकि एकल कोशिका स्तर16 पर जांच किए बिना प्रोटीन की मात्रा का मात्रात्मक आकलन करना मुश्किल है। इसी तरह, पृथक माइक्रोग्लिया के लिए, सीमित उपज के कारण प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग करने के लिए एक लाभ है क्योंकि पश्चिमी धब्बा को बहुत बड़े प्रोटीन इनपुट19 की आवश्यकता होती है। कम सेल नंबर आवश्यकताओं कई धुंधला पैनलों के लिए एक ही जानवर से चलाया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
हालांकि, किसी भी अन्य विधि के साथ, एंटीबॉडी लागत और उपलब्धता सहित इस तकनीक की सीमाएं हैं, क्योंकि सभी एंटीबॉडी प्रवाह साइटोमेट्री सेटिंग में अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं। इसके अलावा, इम्यूनोब्लॉट की तुलना में, आवश्यक एंटीबॉडी की एकाग्रता बहुत अधिक है। जबकि मल्टीप्लेक्सिंग कोशिकाओं के एक ही पैनल पर कई एंटीबॉडी का उपयोग करने की अनुमति देता है, विश्लेषण के बाद कोशिकाओं को एंटीबॉडी से अलग नहीं किया जा सकता है, इस प्रकार सेल उपयोग को प्रति एंटीबॉडी प्रजातियों में से एक तक सीमित किया जा सकता है। यह इम्यूनोब्लॉट से अलग है जिसमें एक ही धब्बा को बार-बार इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एंटीबॉडी की उपलब्धता और साइटोमीटर पर डिटेक्शन चैनलों की संख्या के आधार पर, एक साथ एक दर्जन अंकों तक की जांच करना संभव होगा।
वर्तमान विधि प्रोटीन अभिव्यक्ति के केवल वैश्विक स्तर को पकड़ती है और विशिष्ट जीनोमिक स्थान को नहीं, और वैश्विक स्तरों में परिवर्तन व्यक्तिगत जीनोमिक लोकी में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इसी तरह, वैश्विक स्तर पर बदलाव की कमी का मतलब यह नहीं हो सकता है कि कोई जीनोमिक लोकी परिवर्तन नहीं हो रहा है, बस यह कि वैश्विक परिवर्तनों में उपचार के बीच कोई अंतर नहीं है। जैसे, इस तकनीक का उपयोग जीनोमिक विश्लेषण के लिए एचपीटीएम की पहचान करने के लिए एक स्क्रीन के रूप में किया जाना है। इसके अलावा, इस विधि को नियंत्रण के लिए एक गुना परिवर्तन के रूप में मूल्यांकन किए जाने के अलावा विभिन्न प्रोटीन चिह्नों में तुलना के लिए अनुमति नहीं देता है। इसलिए, यह प्रोटीन निर्धारण के लिए एलिसा जैसे मानक वक्र-आधारित विधि की तुलना में सीमित है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाइव मस्तिष्क माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए P2RY12 प्रोटीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। हालांकि, P2RY12 माइक्रोग्लिया में एक होमोस्टैटिक मार्कर है और इसे 5XFAD22 जैसे रोग मॉडल में डाउनरेगुलेट किया जा सकता है। इसलिए, एक रोग मॉडल जानवर का उपयोग करते समय माइक्रोग्लिया23 के अलगाव में सहायता के लिए TMEM119, सीडी 11 बी, या सीडी 45 जैसे अन्य मार्कर प्रोटीन चुनना सुनिश्चित करें। इसी तरह, हम इस प्रोटोकॉल को हिप्पोकैम्पस और / या प्रांतस्था से अलगाव के रूप में प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सफेद पदार्थ क्षेत्रों सहित अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए काम करेगा, हालांकि, ब्याज के क्षेत्रों के आकार के आधार पर पर्याप्त माइक्रोग्लिया प्राप्त करने के लिए कई जानवरों की आवश्यकता हो सकती है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल मजबूती से लाइव, मस्तिष्क microglia अलग कर सकते हैं, लेकिन वहाँ कई कदम हैं, नीचे वर्णित, अलगाव चरण में है कि सेल उपज कम कर सकते हैं अगर गलत तरीके से प्रदर्शन किया.
इस प्रोटोकॉल के लिए छिड़काव प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़े में माइक्रोग्लिया का एक उच्च प्रतिशत में परिणाम जो सॉर्टर पर समय की मात्रा को कम करेगा. हालांकि, छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, और यदि आवश्यक हो तो इच्छामृत्यु के अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।
माइक्रोग्लिया अलगाव के दौरान, माइलिन को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमीटर तीव्र गति से संकीर्ण टयूबिंग के माध्यम से यात्रा करने में सक्षम कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं। इसकी चिपचिपाहट और टकराने की प्रवृत्ति के कारण, माइलिन साइटोमीटर के साथ समस्याओं का कारण बनता है, अक्सर मोज़री का कारण बनता है जो उपकरण को नुकसान पहुंचा सकता है और नमूने को नष्ट कर सकता है, उपज को काफी कम कर सकता है। नीचे की ओर मुद्दों से बचने के लिए प्रतिरक्षा-समृद्ध टुकड़ों के संग्रह के दौरान सभी माइलिन को हटाने के लिए सतर्क रहें।
प्लेट धुंधला बनाम ट्यूब धुंधला: इस प्रोटोकॉल में, हम या तो 1.5 एमएल ट्यूबों या एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं धुंधला के लिए दो विकल्प का वर्णन. प्रत्येक के लिए उपयोग का मामला प्रयोग पर निर्भर करता है; हालांकि, आम तौर पर ट्यूब धुंधला प्लेट धुंधला हो जाना की तुलना में उपज को प्रभावित करने के लिए कम जोखिम है क्योंकि झटका गलत तरीके से किए जाने पर कोशिकाओं के नुकसान का जोखिम उठाता है। प्लेट धुंधला हो जाना बहुत तेज है क्योंकि प्रत्येक ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला की महाप्राण समय लेने वाली है। निर्धारण से पहले (छँटाई, आदि के लिए), उपज को अधिकतम करने और नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए ट्यूब धुंधला हो जाना का उपयोग करें। हालांकि, एचपीटीएम विश्लेषण के लिए, एक बार कोशिकाओं को इंट्रान्यूक्लियर धुंधला होने के लिए तय किया जाता है, गोली अधिक स्थिर होती है, और फ्लिकिंग के साथ नुकसान का जोखिम कम होता है।
असंतत घनत्व ढाल की स्थापना: लेयरिंग स्थापित करते समय, प्रतिरक्षा समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए परतों को ठीक से स्थापित करना आवश्यक है। यदि परतें परेशान या मिश्रित होती हैं और बादल दिखाई देती हैं, तो कोशिकाएं अपने वांछित स्थान पर नहीं छाँटेंगी, और प्रतिरक्षा-समृद्ध सेल अंश प्राप्त करने में कठिनाई होगी। यदि ऐसा होता है, तो माइलिन को हटाने के लिए घनत्व माध्यम के साथ स्पिन करें और फिर पूरे शेष अंशों को इकट्ठा करें, एफएसीएस बफर के 3 एमएल के साथ घनत्व माध्यम के 1 एमएल तक पतला करें और अच्छी तरह मिलाएं (इसके लिए कई ट्यूबों की आवश्यकता होगी)। 0 पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, केवल ~ 300 माइक्रोन समाधान छोड़कर. पूरे नमूने और दाग ले लीजिए। यह कम सॉर्ट प्रतिशत और साइटोमीटर पर बिताए गए समय की अधिक मात्रा में उपज देगा, लेकिन उपज अभी भी तुलनीय हो सकती है।
अलगाव विधि का उपयोग करते समय, आरएनए के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक ही माउस मस्तिष्क से एचपीटीएम मूल्यांकन के लिए सक्षम होना फायदेमंद होता है। इस स्थिति में, लाइव माइक्रोग्लिया को छाँटने के बाद, कोशिकाओं को आरएनए मूल्यांकन के लिए एक हिस्सा आवंटित करने के लिए विभाजित किया जा सकता है (एक सभ्य आरएनए उपज प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की न्यूनतम इनपुट संख्या 75,000 कोशिकाएं हैं) और आगे प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक हिस्सा (एमएफआई के अच्छे निर्धारण के लिए न्यूनतम 10,000 कोशिकाएं प्रति कुआं)। इस मामले में, फ्लो साइटोमीटर सॉर्टिंग की आवश्यकता होती है। हालांकि, जब केवल एचपीटीएम विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं, तो छँटाई की आवश्यकता नहीं होती है, और प्रतिरक्षा अंश को पी 2 आरवाई 12 एंटीबॉडी और एचपीटीएम एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जा सकता है। साइटोमीटर पर गेटिंग को तब P2RY12+ माइक्रोग्लिया के लिए सेट किया जा सकता है, जैसा कि फ्लो सॉर्टिंग के लिए किया जाएगा, माइक्रोग्लिया के भीतर केवल HPTM सिग्नल का विश्लेषण करने के लिए। छँटाई को खत्म करने से प्रोटोकॉल तेज और अधिक लागत प्रभावी हो सकता है। इसके अलावा, यदि सुसंस्कृत कोशिकाओं से एचपीटीएम का मूल्यांकन किया जाता है, तो धुंधला प्रोटोकॉल पर शुरू करना पर्याप्त है और चित्रा 6में दिखाए गए अनुसार कोई सेल मार्कर एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। एचपीटीएम मूल्यांकन प्रोटोकॉल का उपयोग सुसंस्कृत, प्राथमिक और आईपीएससी व्युत्पन्न कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है।
अंत में, जबकि हमने अलगाव के नीचे की ओर माइक्रोग्लिया के केवल दो संभावित उपयोग प्रस्तुत किए हैं, ऐसे ChIP, CUT &Tag और CUT &RUN जैसे एपिजेनेटिक तकनीकों सहित कई अन्य हैं। जीनोमिक एपिजेनेटिक तकनीकों के मामले में, जहां विशिष्ट लोकी में परिवर्तन की विशेषता रुचि है, लेखकों और क्रोमेटिन के इरेज़र के लिए विशिष्ट अवरोधकों का चयन करें11 प्रयोगों के अनुरूप यह सुनिश्चित करने के लिए कि किसी भी माइक्रोग्लियल एपिजेनेटिक संशोधनों को प्रोफाइल किया गया है, एंजाइमी पाचन जैसे अलगाव प्रक्रिया में किसी भी कदम से तकनीकी कलाकृतियां नहीं हैं। एपिजेनेटिक चिह्नों के वैश्विक स्तर में परिवर्तन का आकलन करते समय, जैसे मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके, किसी भी प्रक्रिया-प्रेरित परिवर्तन के इतने बड़े होने की उम्मीद नहीं है कि वे वैश्विक स्तर पर पाए जाते हैं।
कुल मिलाकर, चर्चा की गई विधियां प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हिस्टोन संशोधनों और अन्य एपिजेनेटिक परिवर्तनों के वैश्विक स्तर को निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास, एकल कोशिका विधि प्रदान करती हैं। हमने प्रदर्शित किया कि यह विधि विवो में एलपीएस के जवाब में माइक्रोग्लिया में एन्हांसर मार्कर H3K27ac में वैश्विक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है। यह एलपीएस उत्तेजना के बाद H3K27ac के पिछले ChIP-अनुक्रमण के अनुरूप है, जो LPS28 के प्रति उत्तरदायी एन्हांसर्स के नाटकीय रीमॉडेलिंग को दर्शाता है। इस विधि के अनुप्रयोगों विकास और रोग में विभिन्न मस्तिष्क कोशिका प्रकार भर में वैश्विक epigenetic परिवर्तन की परीक्षा के लिए अनुमति देगा.
The authors have nothing to disclose.
चित्रा 5 में इम्यूनोब्लॉट के साथ मदद करने के लिए यानयांग बाई के लिए धन्यवाद। इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों [सीआरसी-आरएस 950-232402 से एसी] द्वारा समर्थित किया गया था; कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 से AC]; स्कॉटिश राइट चैरिटेबल फाउंडेशन [21103 से एसी] और ब्रेन कनाडा फाउंडेशन [AWD-023132 से एसी]; ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय आदिवासी स्नातक फैलोशिप (6481 से एमटी); ब्रिटिश कोलंबिया ग्रेजुएट स्कॉलरशिप (6768 से एमटी); कैनेडियन ओपन न्यूरोसाइंस प्लेटफॉर्म स्टूडेंट स्कॉलर अवार्ड (10901 से जेके); ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय चार वर्षीय डॉक्टरेट फैलोशिप (6569 से जेके)। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशन के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
0.5M EDTA | Invitrogen | AM9260G | |
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Falcon | 352196 | |
24-well Clear Not Treated Plates | Costar | 3738 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface | Corning | 3788 | |
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) | Cell Signalling Technology | 9649S | Dilution: 1:100 |
Acetyl Histone H4 K8 (2594) | Cell Signalling Technology | 2594S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) | Cell Signalling Technology | 8173S | Dilution: 1:100 |
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) | Invitrogen | MA523516 | Dilution: 1:100 |
Actinomycin D | New England Biolabs | 15021S | |
Anisomycin | New England Biolabs | 2222S | |
Anti-Histone H3 (tri methyl K4) | Abcam | ab213224 | Dilution: 1:100 |
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb | PTM Biolabs | PTM-1411RM | Dilution: 1:250 |
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb | PRM Biolabs | PTM-1401RM | Dilution: 1:250 |
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D | BioLegend | 848006 | |
BSA | Tocris | 5217 | |
Cyto-Last Buffer | BioLegend | 422501 | |
dimethylsulfoxide, sterile | Cell Signalling Technology | 12611S | |
DNAse I | STEMCELL Technologies | 07900 | |
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 | Jackson ImmunoResearch | 715-546-150 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 | ABclonal | AS035 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 | Invitrogen | A10042 | Dilution: 1:500 |
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 | BioLegend | 406410 | Dilution: 1:500 |
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL | Fisherbrand | FB12566502 | |
H3K18ac Polyclonal Antibody | Invitrogen | 720095 | Dilution: 1:100 |
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14185052 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175103 | |
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) | Abcam | ab6002 | Dilution: 1:100 |
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL | VWR | 885300-0007 | |
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb | PTM BIolabs | PTM-1406RM | Dilution: 1:250 |
Lipopolysacharide | Sigma-Aldrich | L5418 | |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
OneComp eBeads Compensation Beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
PDS Kit, Papain Vial – Worthington Biochemical | Cedarlane | LK003178 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | GE17-0891-02 | |
Phenol Red | VWR | RC57004 | |
QIAshredder | Qiagen | 79656 | |
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM – Mid Range Intensity | BioLegend | 422905 | |
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Invitrogen | AM12400 | |
Rneasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL | Corning | 352063 | |
Triptolide | New England Biolabs | 97539 | |
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set | BioLegend | 424401 | |
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 156604 | |
Trypan Blue | VWR | 97063-702 | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 |