Method Article

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

DOI:

10.3791/65082

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December 22nd, 2023

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1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Abstract

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La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfa a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono deteriorarsi in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale. Il cuore di topo è una specie molto diffusa per la modellazione di malattie aritmiche cardiache ereditarie, tra cui la CPVT. La mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana (Vm) e dei transienti di calcio (CaT) da cuori di topo perfusi con Langendorff ha il potenziale per chiarire i meccanismi alla base dell'aritmogenesi. Rispetto all'indagine a livello cellulare, la tecnica di mappatura ottica può testare alcuni parametri elettrofisiologici, come la determinazione dell'attivazione, la velocità di conduzione, la durata del potenziale d'azione e la durata del CaT. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ottica ad alto rendimento di CaT e Vm in cuori murini wild-type ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e durante la sfida con isoproterenolo. Questo approccio ha dimostrato un metodo fattibile e affidabile per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in una preparazione cardiaca di topo ex vivo.

Introduction

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Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfica (PVT) a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono degenerare in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale 1,2,3,4 . Recenti evidenze a seguito del suo primo rapporto come sindrome clinica nel 1995 implicavano mutazioni in sette geni, tutti coinvolti nel rilascio di Ca 2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) in questa condizione: il più frequentemente riportato RYR2 che codifica ....

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Protocol

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Per gli esperimenti vengono utilizzati topi maschi di età compresa tra 10 e 14 settimane di età o topi RyR2-R2474S/+ (sfondo C57BL/6) del peso di 20-25 g. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali della Southwest Medical University, Sichuan, Cina (approvazione n.: 20160930) in conformità con le linee guida nazionali in base alle quali opera l'istituto.

1. Preparazione

  1. Soluzioni di magazzino
    1. Soluzione madre di blebbistatina: aggiungere 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) al 100% nel matraccio originale contenente 2,924 mg di (-) polvere di blebbistatina per ....

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Results

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La mappatura ottica è stata un approccio popolare nello studio delle aritmie cardiache complesse nell'ultimo decennio. La configurazione di mappatura ottica è costituita da una telecamera EMCCD, che fornisce una frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz e una risoluzione spaziale di 74 x 74 μm per ogni pixel. Consente un rapporto segnale-rumore piuttosto elevato durante il campionamento del segnale (Figura 1). Una volta che il cuore perfuso di Langendorff raggiunge uno stato stabile e il ca.......

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Discussion

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Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per una mappatura ottica a doppio colorante di successo di un cuore di topo includono una soluzione e un cuore ben preparati, il caricamento del colorante, il raggiungimento del miglior rapporto segnale/rumore e la riduzione dell'artefatto da movimento.

Preparazione della soluzione
La soluzione di Krebs è essenziale per il successo di un esperimento sul cuore. Le soluzioni madre di MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) .......

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Disclosures

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Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

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Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81700308 a XO e 31871181 a ML e da 82270334 a XT), dal Programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia di Sichuan (CN) (da 2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT e da 2022NSFSC1602 a TC) e dal Laboratorio chiave statale per la chimica e l'ingegneria molecolare delle risorse medicinali (Guangxi Normal University) (da CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE a Oxford (ML) sovvenzioni.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 μ m filtro siringaFabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, CinaN/APer filtrare la soluzione
15 ml di provetta da centrifugaGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. CinaCFT011150
1 ml Pasteur pipettaBeijing Labgic Technology Co., Ltd. Cina00900026
1 ml siringaB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μ L Provetta PCRSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. CinaF611541-0010Aliquote le soluzioni di riserva  per evitare il congelamento ripetuto e lo scongelamento
50 ml provetta da centrifugaGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. CinaCFT011500Store Soluzione di Tyrode a 4 ° C per l'isolamento cardiaco di follow-up
Filtro 585/40 nmChroma TechnologyN/AFiltro per il segnale del calcio
Filtro passa-lungo 630 nmChroma TechnologyG15604AJFiltro per il segnale di tensione
Avertin (2,2,2-tribromoetanolo)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Regno UnitoT48402-100GPer ridurre al minimo la sofferenza e il riflesso del dolore
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, Stati UnitiSLBV5564 Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione per eliminare gli artefatti di movimento durante la mappatura
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiSLBK1794VPer la soluzione di Tyrode
Bagno termostatico su misuraMappingLab, Regno UnitoTBC-2.1Per mantenere la temperatura della soluzione
di perfusioneDimetil solfossido (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvente per coloranti
Pinze Dumont Fabbricadi apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, CinaYAF030
Software ElectroMapUniversità di BirminghamN/AQuantificazione dei parametri elettrici
Fotocamera EMCCDEvolve 512 Delta, Fotometria, Tucson, AZ, StatiUnitiA18G150001Acquisire immagini per segnali ottici
ET525/36 filtro rivestito per polverizzazione catodicaTecnologia Chroma319106Filtro di eccitazione
GlucosioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiSLBT4811VPer la soluzione di Tyrode
Eparina sodicaChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Cina(H51021209)Per prevenire coaguli di sangue nell'arteria coronaria
  Pinze dell'irideFabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, CinaYAA010
IsoproterenoloMedChemExpress, Carlsbad, CA, Stati UnitiHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiSLBS5003Per la soluzione di Tyrode
MacroLEDCairn Research, Faversham, Regno Unito7355/7356La luce di eccitazione delle sonde a fluorescenza
Sorgente luminosa MacroLEDCairn Research, Faversham, Regno Unito7352Controllo dei LED
ForbiciMayo Fabbrica di apparecchiature mediche di Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, CinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/ACampionamento dei segnali ottici
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiBCBS6841VPer la soluzione di Tyrode
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, Regno UnitoM5337Collegare lo stimolatore elettrico e il software Spike2
Stimolatore di campo MyoPacer EPIon Optix Co, Milton, MA, Stati UnitiS006152Stimolatore elettrico
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiSLBS2340VPer la soluzione di Tyrode
NaH2PO4  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiBCBW9042Per la soluzione di Tyrode
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stati UnitiSLBX3605Per la soluzione di Tyrode
SistemaNeuroLog DigitimerNL905-229Per amplificatore ECG
OmapScope5MappingLab, Regno UnitoN/AAlternanti di calcio e Analisi dell'aritmia
Forbici oftalmicheHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, CinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, Regno Unito6970Dividere la luce di emissione per rilevare Ca2+ e Vm  contemporaneamente
Pompa peristalicaLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Cina, BT100-2JPer pompare la soluzione
Piastra di PetriBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti1899021Per migliorare il carico con Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Stati Uniti1971387Colorante sensibile alla tensione
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, Stati Uniti1890519Indicatore di calcio
Tubo in gel di siliceLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Cina,96402-16Collegare con la pompa peristaltica
Sutura di setaYuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Cina20172650032Per riparare l'aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, Regno UnitoN/APer registrare e analizzare i dati ECG
Stimolazione elettrodoMappingLab, Regno UnitoSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461Per sorgente luminosa
T565lpxrChroma Technology321343Per sorgente luminosa

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. P....

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