在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。
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本文内容
摘要
摘要
棕色脂肪组织（BAT）是一种专门用于能量耗散的脂肪储存库，也可通过分泌生物活性分子作为内分泌器官。via 利用Cre-LoxP系统进行基因靶向的传统策略一直是构建组织特异性基因敲除小鼠的主要方法。然而，该方法耗时且繁琐。本文介绍了一种结合Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统的快速高效敲除BAT中目标基因的实验方案。肩胛间BAT位于肌肉深层之间，因此必须暴露BAT，以便在视野范围内精确且直接地将AAV注射到BAT中。适当的外科操作至关重要，以避免损伤支配BAT的交感神经和血管（例如连接BAT的Sultzer静脉）。为最大限度减少组织损伤，必须充分理解BAT的三维解剖位置以及技术操作所需的手术技能。本方案重点阐述了关键的技术步骤，包括靶向目标基因的sgRNA设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及通过直接显微注射将AAV注入双侧BAT叶以构建BAT特异性基因敲除小鼠的手术操作，该方法可广泛应用于研究基因在BAT中的生物学功能。
引言
肥胖在全球范围内以显著速度增长，导致一系列代谢性疾病1,2,3脂肪组织在这些病理过程中起着关键作用。目前已知存在两种功能不同的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT），负责储存多余热量；棕色脂肪组织（BAT）及其相关的米色/类棕色脂肪（beige/brite fat），则通过产热作用耗散能量。尽管BAT的能量耗散功能已被广泛认知，但它同时也具有内分泌功能。 通过 在远端器官中调控代谢的生物活性分子的产生4,5大量啮齿类动物研究表明，增加棕色脂肪或米色脂肪的数量或活性可提高能量消耗，并改善胰岛素敏感性。在人类中，可检测到棕色脂肪组织（BAT）的人群，其心脑血管代谢性疾病的患病率显著较低。6因此，BAT 对肥胖相关的代谢后遗症具有良好的治疗潜力7,8,9.
为了研究棕色脂肪组织（BAT）发育与功能的生理学及病理生理学机制，并阐明参与这些过....
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方案
所有动物实验和护理程序均经乔斯林糖尿病中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 在培养细胞中筛选有效的单导向RNA
注意：为了降低检测成本，在将sgRNA包装成AAV颗粒之前，建议先在培养细胞中测试不同的sgRNA 通过 基于慢病毒的 Cas9/sgRNA 表达系统图1）并筛选出敲低效率最高的sgRNA 体内 实验。
- CRISPR-Cas9 sgRNA设计
- 使用在线工具（如 Broad sgRNA 设计工具，https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）设计 sgRNA20,21，CRISPOR 在线工具（http://crispor.tefor.net/）22及其他可用工具。
- 在基因名称框中输入基因名称或DNA靶序列，并选择 NGG 作为SpCas9生成潜在sgRNA序列的原间隔序列邻近基序（PAM）。
- 选择具有高预测靶向效率和低脱靶活性的....
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结果
在整个上述操作过程中，将AAV-sgRNA精确递送至棕色脂肪组织（BAT）对于本实验方案的成功至关重要。为了最大化AAV-sgRNA的作用效果并尽量减少手术过程中的组织损伤，必须充分了解BAT的三维（3D）解剖位置。如图所示 图3E，如果不暴露组织，很难确定棕色脂肪组织（BAT）的精确位置。然而，过度暴露BAT可能会损伤组织图3H，I）；因此，应通过操作将AAV溶液注射至有限的解剖空间内（图 3G). 图 5A 对于确保AAV注射的成功以及小鼠术后快速恢复至关重要。 图5B-D 表明可能导致注射失败的潜在缺陷。这些缺陷包括将AAV溶液注射到错误的区域（图5B），针头穿透组织（
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讨论
现有的关于通过腺相关病毒（AAV）介导将基因递送至肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的方法，均未包含详细描述手术技术及直接向BAT注射AAV操作过程的图片和视频。在大多数已发表的方法中33,34，将AAV注射到肩胛间棕色脂肪组织（BAT）周围的脂肪组织中，而非直接注射到BAT本身。因此，本实验方案中有多个关键步骤决定了研究的成败，包括sgRNA的设计、AAV的包装与浓缩、BAT特异性Cas9小鼠的构建以及手术操作。完成该过程需要精细且高超的外科手术技能 体内 操作步骤。特别是，在暴露棕色脂肪组织（BAT）和注射腺相关病毒（AAV）时，尽量减少组织损伤至关重要。由于多种遗传和环境因素（如饲养温度、运动训练和饮食），围绕BAT的白色脂肪体积以及BAT本身的组成在不同动物之间可能存在差异。例如，肥胖小鼠的BAT周围存在大量白色脂肪组织，而在热中性环境（30 °C）下饲养的小鼠则表现出BAT的“白色化”。因此，在不切开皮肤的情况下，精确确定BAT的三维位置具有挑战性。在AAV注射过程中，尽可能小范围地暴露BAT是一项.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01DK122808、R01DK102898 和 R01DK132469（授予 Y.-H.T.），以及 P30DK036836（授予乔斯林糖尿病中心糖尿病研究中心）。T. T. 获得了SUNSTAR研究奖学金（Hiroo Kaneda 奖学金，Sunstar 基金会，日本）和美国心脏协会资助项目 903968 的支持。Y. Z. 获得了查尔斯·A·金信托奖学金的支持。我们感谢 Sean D. Kodani 对手稿的仔细校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂、多肽与重组蛋白 | |||
| OPTI-MEM 无血清培养基 | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene 感染/转染试剂 | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 转染试剂 | Mirus | MIR 2300 | |
| 重组DNA | |||
| lentiCRISPR v2 载体 | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G 包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 实验模型：细胞系 | |||
| HEK-293 细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 细胞 | Tseng 实验室构建 | PMID: 14966273 | |
| 实验模型：生物体/品系 | |||
| Cas9 基因敲入小鼠 | Jackson 实验室 | 24857 | |
| Ucp1-CRE 小鼠 | Jackson 实验室 | 24670 | |
| 其他 | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton 注射器 | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| 过氧化氢溶液 | Fisher Scientific | H325-500 | |
| 针头 | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| 缝合线 5-0 Unify PCL25 P-3 无色 18 英寸 单股 12/盒 | Henry Schein | 1273504 | |
| 缝合线 5-0 Unify 丝线 P-3 黑色 18 英寸 12/盒 | Henry Schein | 1294522 |
参考文献
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S.
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重印与许可
