בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus
במאמר זה
סיכום
תקציר
רקמת שומן חומה (BAT) היא מחסן שומן המתמחה בפיזור אנרגיה שיכול לשמש גם כאיבר אנדוקריני באמצעות הפרשת מולקולות ביו-אקטיביות. יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT היא אחת הגישות הפופולריות ביותר להבנת תרומתו של גן מעניין לוויסות אנרגיה בתיווך BAT. אסטרטגיית מיקוד הגנים הקונבנציונלית המשתמשת במערכת Cre-LoxP הייתה הגישה העיקרית ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמות. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן ומייגעת. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לנוקאאוט מהיר ויעיל של גן בעל עניין ב-BAT באמצעות מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). ה- BAT interscapular ממוקם בשכבה העמוקה בין השרירים. לכן, ה-BAT חייב להיות חשוף על מנת להזריק את ה-AAV בצורה מדויקת וישירה לתוך ה-BAT בתוך שדה הראייה. טיפול כירורגי מתאים הוא חיוני למניעת נזק לעצבים ולכלי הדם הסימפתטיים, כגון וריד הזולצר המתחבר ל- BAT. כדי למזער את הנזק לרקמות, יש צורך קריטי להבין את המיקום האנטומי התלת מימדי של ה- BAT ואת המיומנויות הכירורגיות הנדרשות בשלבים הטכניים. פרוטוקול זה מדגיש את ההליכים הטכניים העיקריים, כולל תכנון sgRNA המכוון לגן המעניין, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, והניתוח למיקרו-הזרקה ישירה של AAV לשתי אונות BAT ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים ל-BAT, שניתן ליישם באופן נרחב כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של גנים ב-BAT.
מבוא
השמנת יתר עולה בקצב משמעותי ברחבי העולם, מה שמוביל למגוון רחב של מחלות מטבוליות 1,2,3. רקמת השומן היא המפתח לפתולוגיות אלה. שני הסוגים השונים מבחינה תפקודית של רקמת השומן הקיימים הם רקמת השומן הלבנה (WAT), המאחסנת קלוריות עודפות, ורקמת השומן החומה (BAT) ושומן הבז'/בריט הקשור אליה, המפזרים אנרגיה לצורך תרמוגנזה. בעוד BAT כבר מוכר על תפקוד פיזור האנרגיה שלה, יש לו גם פונקציות אנדוקריניות באמצעות ייצור של מולקולות ביו-אקטיביות המווסתות את חילוף החומרים באיברים דיסטליים 4,5. מחקרים רבים במכרסמים הוכיחו כי הגדלת כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים והליכי הטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז ג'וסלין לסוכרת.
1. סינון sgRNA יעיל בתאים בתרבית
הערה: כדי להפוך את הבדיקה לחסכונית, לפני אריזת ה-sgRNA לחלקיקי AAV, אנו ממליצים לבדוק sgRNA שונים בתאים בתרבית באמצעות מערכת מבוססת לנטיוירוס עבור ביטוי Cas9/sgRNA (איור 1) ולבחור את ה-sgRNA שנותנים את יעילות ההפלות הגבוהה ביותר עבור ניסויי in vivo .
- עיצוב CRISPR-Cas9 sgRNA
- עצב sgRNA באמצעות כלים מקוונים, כגון כלי העיצוב הרחב sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאורך כל ההליכים לעיל, המסירה המדויקת של AAV-sgRNA ל- BAT היא קריטית להצלחת הפרוטוקול. כדי למקסם את ההשפעה של AAV-sgRNA ולמזער את הנזק לרקמות במהלך הניתוח, חיוני להבין את המיקום האנטומי התלת-ממדי (3D) של ה- BAT. כפי שניתן לראות באיור 3E, קשה לזהות את המיקום המדויק של ה-BAT מבלי לחשוף את הרקמה. אולם חשיפה עודפת ל-BAT עלולה לפגוע ברקמה (איור 3H, I); לכן, יש לבצע את ההליך להזרקת תמיסת AAV בתוך מרחב אנטומי מוגבל (איור 3G).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטות הקיימות שפורסמו להעברת גנים בתיווך AAV ל- BAT interscapular אינן מכילות תמונות וסרטונים מפורטים המתארים את טכניקות הניתוח ואת הגישה להזרקת AAV ישירה ל- BAT. ברוב השיטות שפורסמו33,34, AAV מוזרק לתוך רקמות השומן סביב BAT interscapular במקום BAT עצמו. לפיכך, ישנם מספר שלבים מרכזיים בפרוטוקול זה הקובעים את הצלחת המחקר. אלה כוללים את העיצוב של sgRNA, אריזה AAV וריכוז, הדור של עכברי Cas9 ספציפיים BAT, ואת ההליכים הכירורגיים. מיומנויות כירורגיות זהירות ומצטיינות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ו-R01DK132469 (ל-Y.-H.T.), כמו גם P30DK036836 (למרכז לחקר הסוכרת של מרכז ג'וסלין). T. T. נתמך על ידי מלגת המחקר SUNSTAR (מלגת Hiroo Kaneda, קרן Sunstar, יפן) ומענק איגוד הלב האמריקאי 903968. י.ז. נתמך על ידי מלגת קרן צ'ארלס א. קינג. אנו מודים לשון ד. קודאני על ההגהה האדיבה של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים | |||
| OPTI-MEM מדיום נטול סרום | Invitrogen | 31985 | |
| זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציה | סיגמא | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 מגיב טרנספקציה | Mirus | MIR 2300 | |
| DNA | |||
| lentiCRISPR v2 וקטור | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G מעטפת פלסמיד | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 אריזת פלסמיד | Addgene | 12260 | |
| מודלים ניסיוניים: קווי תאים | |||
| תאי HEK-293 תאי | ATCC CRL-1573 | ||
| WT-1 | פותח במעבדת Tseng | PMID: 14966273 | |
| מודלים ניסיוניים: אורגניזמים/זנים | |||
| Cas9 עכברי נוקין | מעבדות ג'קסון | 24857 | |
| עכברי Ucp1-CRE | מעבדות ג'קסון | 24670 | |
| אחרים | |||
| בנמין | פטרסון | 07-859-1323 | |
| המילטון מזרק | המילטון | דגם 710 RN מזרק | |
| תמיסת מי חמצן | פישר סיינטיפיק | H325-500 | |
| מחט | המילטון | 32 מד, מחט RN רכזת קטנה, מחט נקודת מחט בסגנון 2 | |
| תפר 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 אינץ' מונופילמנט 12/Bx | הנרי שיין | 1273504 | |
| תפר 5-0 Unify Silk P-3 שחור 18 אינץ' 12/Bx | הנרי שיין |
מקורות
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
