Aufklärung des Metabolismus von 2,4-Dibromphenol in Pflanzen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung von 2,4-Dibromphenol-Metaboliten in Pflanzen.
Abstract
Nutzpflanzen können in großem Umfang organischen Schadstoffen ausgesetzt sein, da der Boden eine wichtige Senke für Schadstoffe ist, die in die Umwelt gelangen. Dies führt zu einer potenziellen Exposition des Menschen durch den Verzehr von Lebensmitteln, die mit Schadstoffen angereichert sind. Die Aufklärung der Aufnahme und des Stoffwechsels von Xenobiotika in Nutzpflanzen ist für die Bewertung des ernährungsbedingten Expositionsrisikos beim Menschen von entscheidender Bedeutung. Für solche Experimente erfordert die Verwendung intakter Pflanzen jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können. Pflanzenkalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) können eine Lösung für die genaue und zeitsparende Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen darstellen, da sie Störungen durch die mikrobielle oder pilzliche Mikroumgebung vermeiden, die Behandlungsdauer verkürzen und den Matrixeffekt intakter Pflanzen vereinfachen können. 2,4-Dibromphenol, ein typisches Flammschutzmittel und endokriner Disruptor, wurde aufgrund seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden und seines Aufnahmepotenzials durch Pflanzen als Modellsubstanz ausgewählt. Hierin wurde Pflanzenkallus aus Asepsissamen erzeugt und einem sterilen 2,4-Dibromphenol-haltigen Nährmedium ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 120 h Inkubation acht Metaboliten von 2,4-Dibromphenol im Kallusgewebe der Pflanzen identifiziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass 2,4-Dibromphenol in den pflanzlichen Kallusgeweben schnell metabolisiert wurde. Somit ist die Pflanzenkalluskulturplattform eine effektive Methode, um die Aufnahme und den Metabolismus von Xenobiotika in Pflanzen zu bewerten.
Introduction
Immer mehr organische Schadstoffe werden aufgrund anthropogener Aktivitäten in die Umwelt abgegeben 1,2, und der Boden gilt als wichtige Senke für diese Schadstoffe 3,4. Die Schadstoffe im Boden können von Pflanzen aufgenommen und möglicherweise auf Organismen auf höherer trophischer Ebene entlang der Nahrungsketten übertragen werden, indem sie durch den Verzehr von Pflanzen direkt in den menschlichen Körper gelangen, was zu einer unbeabsichtigten Exposition führt 5,6. Pflanzen nutzen verschiedene Wege, um Xenobiotika zur Entgiftung zu verstoffwechseln7; Die Aufklärung des Stoffwechsels von Xenobiotika ist wichtig, da sie den tatsächlichen Verbleib von Schadstoffen in Pflanzen steuert. Da die Metaboliten über die Blätter (in die Atmosphäre) oder die Wurzeln ausgeschieden werden können, bietet die Bestimmung der Metaboliten in den sehr frühen Expositionsphasen die Möglichkeit, eine größere Anzahl von Metaboliten zu testen8. Studien mit intakten Pflanzen erfordern jedoch Langzeitexperimente und komplexe Probenvorbereitungsprotokolle, die von verschiedenen Faktoren beeinflusst werden können.
Pflanzliche Kalluskulturen sind daher eine gute Alternative, um den Stoffwechsel von Xenobiotika in planta zu untersuchen, da sie die Behandlungszeit stark verkürzen können. Diese Kulturen schließen mikrobielle Interferenz und photochemischen Abbau aus, vereinfachen den Matrixeffekt intakter Pflanzen, standardisieren die Kultivierungsbedingungen und erfordern weniger experimentellen Aufwand. Pflanzliche Kalluskulturen wurden erfolgreich als alternativer Ansatz in Stoffwechselstudien von Triclosan9, Nonylphenol10 und Tebuconazol8 eingesetzt. Diese Studien zeigten, dass die Stoffwechselmuster in Kalluskulturen denen in intakten Pflanzen ähnelten. Diese Studie schlägt eine Methode zur effizienten und genauen Identifizierung von Metaboliten von Xenobiotika in Pflanzen ohne komplexe und zeitaufwändige Protokolle vor. Hier verwenden wir pflanzliche Kalluskulturen in Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie für die Analyse von Metaboliten mit Signalen niedriger Intensität11,12.
Zu diesem Zweck wurden Kallussuspensionen aus Karotten (Daucus carota var. sativus) 120 μg/l 2,4-Dibromphenol für 120 h in einem Schüttler bei 130 U/min und 26 °C ausgesetzt. 2,4-Dibromphenol wurde aufgrund seiner störenden endokrinen Aktivität13 und seines weit verbreiteten Vorkommens im Boden14 ausgewählt. Die Metaboliten wurden extrahiert und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert. Das hier vorgeschlagene Protokoll kann den In-planta-Metabolismus anderer Arten von organischen Verbindungen, die ionisiert werden können, untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Biotransformation von Xenobiotika in Pflanzen effizient zu identifizieren. Der kritische Schritt dieses Protokolls ist die Kultivierung der Pflanzenkallus. Der schwierigste Teil ist die Differenzierung und Pflege des Pflanzenkallus, da der Pflanzenkallus leicht infiziert wird und sich zu Pflanzengewebe entwickelt. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle verwendeten Geräte autoklaviert sind und alle Vorgänge unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Die Differ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (21976160) und dem Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (LGF21B070006) unterstützt.
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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