JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Beskyttelse af H9c2 myokardceller mod oxidativ stress af Crocetin via PINK1 / Parkin Pathway-medieret mitofagi;

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65105
, , , , , ,
1School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital,Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Baseret på in vitro-eksperimenter afslørede denne undersøgelse crocetins mekanisme til reparation af oxidativ stressskade på kardiomyocytter ved at påvirke mitofagi, hvor PINK1 / Parkin-signalvejen spiller en vigtig rolle.

Abstract

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge den oxidative stressbeskyttende virkning af crocetin på H2O2-medierede H9c2-myokardceller gennem in vitro-eksperimenter og yderligere undersøge, om dens mekanisme er relateret til virkningen af mitofagi. Denne undersøgelse havde også til formål at demonstrere den terapeutiske virkning af saflorsyre på oxidativ stress i kardiomyocytter og undersøge, om dens mekanisme er relateret til effekten af mitofagi. Her blev en H 2 O2-baseretoxidativ stressmodel konstrueret og vurderet graden af oxidativ stressskade af kardiomyocytter ved at detektere niveauerne af lactat dehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutathionperoxidase (GSH Px). Reaktive iltarter (ROS)-detekterende fluorescerende farvestof DCFH-DA, JC-1 farvestof og TUNEL farvestof blev anvendt til at vurdere mitokondrieskader og apoptose. Autofagisk flux blev målt ved transfektering af Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagy-relaterede proteiner blev derefter påvist via western blotting og immunofluorescens. Crocetin (0,1-10 μM) kunne imidlertid forbedre cellelevedygtigheden betydeligt og reducere apoptose og oxidativ stressskade forårsaget afH2O2. I celler med overdreven autofagisk aktivering kunne crocetin også reducere autofagistrømmen og ekspressionen af mitofagirelaterede proteiner PINK1 og Parkin og vende overførslen af Parkin til mitokondrier. Crocetin kunne reducere H2O2-medieret oxidativ stressskade og apoptose af H9c2-celler, og dets mekanisme var tæt forbundet med mitofagi.

Introduction

Akut myokardieinfarkt (AMI) er en livstruende myokardienekrose forårsaget af alvorlig og vedvarende iskæmi og hypoxi i koronararterierne 1,2. Perkutan koronar intervention (PCI) er en af de første linje terapeutiske strategier for AMI og beskytter normalt kardiomyocytter mod iskæmisk skade 3,4. Det distale myokardium mangler blod- og iltforsyning, hvis det ikke behandles hurtigt og effektivt efter AMI, hvilket fører til iskæmisk nekrose og yderligere kardiovaskulære komplikationer 5,6. Fremme af kardiomyocytgendannelse og minimering af irreversibel myokardieskade efter at have savnet PCI-kirurgisk mulighed har været et forskningshotspot. Efter AMI er kardiomyocytter i en tilstand af iskæmi og hypoxi, hvilket resulterer i hæmning af mitokondriel oxidativ phosphorylering, reduktion af NAD+ til NADPH og øget enkeltelektronreduktion7. Som følge heraf genererer den ufuldstændige reduktionsreaktion af ilt et overskud af reaktive iltarter (ROS) og fører i sidste ende til oxidativ stressskade på kardiomyocytter8. En overdreven ophobning af ROS udløser lipidperoxidation, hvilket yderligere forstyrrer mitokondriemembranernes struktur og funktion. Resultatet er en kontinuerlig åbning af mitokondriepermeabilitetsovergangsporer og et fald i mitokondriemembranpotentiale, hvilket inducerer apoptose og nekrose.

Angiotensinkonverterende enzym (ACE) hæmmere, angiotensinreceptorblokkere (ARB’er), hæmmere af β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister og andre standardlægemidler i AMI kan hjælpe med at forbedre hjertefunktionen efter myokardieinfarkt og forhindre forekomsten af ondartede hændelser, såsom arytmier og venstre ventrikulær remodellering9. Imidlertid påvirkes overlevelse og prognose efter infarkt stærkt af infarktstørrelse, og der er ikke opnået tilfredsstillende resultater for reduktion af kardiomyocytapoptose10,11. Således er udviklingen af lægemidler til fremme af kardiomyocytgendannelse efter myokardieinfarkt blevet et presserende problem.

Traditionel medicin har været en inspirationskilde for moderne farmaceutisk forskning i mange år12,13,14,15. Traditionel kinesisk medicin (TCM) har en lang historie i behandlingen af AMI, og en række randomiserede kontrolforsøg i de senere år har bekræftet, at TCM faktisk kan forbedre prognosen for patienter16,17. Ifølge TCM-teorien er AMI forårsaget af blodstasis18,19, så lægemidler til fremme af blodcirkulationen bruges normalt til behandling af AMI i den akutte fase20. Blandt dem menes safran at have en kraftig effekt på blodaktivering og stasis, og bruges ofte til akut behandling af AMI. Crocetin, en vigtig bestanddel af safran, kan spille en central rolle i beskyttelsen af kardiomyocytter21.

I denne undersøgelse blev H9c2 myokardceller induceret afH2O2for at simulere myokardieiskæmi/reperfusion, hvilket forårsager en kardiomyocytskade på AMI, og crocetin blev anvendt som en intervention for at undersøge dets beskyttende virkning mod oxidativ stressinduceret myokardieskade. Mekanismen for crocetin, der beskytter kardiomyocytter, blev yderligere undersøgt gennem mitofagi. Endnu vigtigere er det, at denne artikel giver en reference til den tekniske tilgang til undersøgelsen af mitofagi, og beskriver hele eksperimentproceduren i detaljer.

Protocol

Eksperimenterne blev udført i laboratoriet for fysiologi ved Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alle undersøgelsesmetoder blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og regler fra Beijing Universitet. 1. Cellekultur Tilsæt 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin til Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) basisk medium (med 4,5 g / L D-glucose, 4.g.g / L L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat; se material…

Representative Results

Virkninger af crocetin på celle levedygtighedCrocetin ved 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM og 100 μM havde en signifikant proliferativ virkning på celler, mens crocetin i koncentrationer over 200 μM signifikant hæmmede proliferation af H9c2-celler (figur 1A). Efter 4 timers behandling med 400 μMH2O2blev cellelevedygtigheden reduceret betydeligt, og crocetin kunne til en vis grad vende denne ændring (figur 1B…

Discussion

Udforskningen af effektive ingredienser fra komplekse forbindelser af naturlige lægemidler gennem avanceret teknologi har været et hotspot for TCM-forskning29 og kan give laboratoriebevis for fremtidig lægemiddeludvikling efter verifikation. Saflor er et repræsentativt lægemiddel til behandling af “fremme af blodcirkulationen og minimering af blodstasis” og anvendes i vid udstrækning til behandling af myokardieinfarkt30,31. Safran me…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) og National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

Keywords: H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetinPINK1/Parkin PathwayMitophagyROS DetectionMitochondrial Membrane PotentialTUNEL Assay
check_url/65105?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image