JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Beskyttelse av H9c2 myokardceller fra oksidativt stress av Crocetin via PINK1 / Parkin Pathway-mediert mitofagi

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65105
, , , , , ,
1School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital,Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Basert på in vitro-eksperimenter avslørte denne studien crocetins mekanisme for å reparere oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å påvirke mitofagi, hvor PINK1 / Parkin-signalveien spiller en viktig rolle.

Abstract

Denne studien hadde som mål å utforske den oksidative stressbeskyttende effekten av crocetin påH2O2-medierteH9c2-myokardceller gjennom in vitro-eksperimenter, og videre undersøke om mekanismen er relatert til virkningen av mitofagi. Denne studien hadde også som mål å demonstrere den terapeutiske effekten av saflorsyre på oksidativt stress i kardiomyocytter og undersøke om mekanismen er relatert til effekten av mitofagi. Her ble en H 2 O2-basertoksidativ stressmodell konstruert og vurdert graden av oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å oppdage nivåene av laktatdehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutationperoksidase (GSH Px). Reaktive oksygenarter (ROS)-detekterende fluorescerende fargestoff DCFH-DA, JC-1 fargestoff og TUNEL fargestoff ble brukt for å vurdere mitokondriell skade og apoptose. Autofagisk fluks ble målt ved transfeksjon av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagirelaterte proteiner ble deretter påvist via vestlig blotting og immunfluorescens. Imidlertid kan crocetin (0, 1-10 μM) forbedre cellens levedyktighet betydelig og redusere apoptose og oksidativ stressskade forårsaket avH 2 O2. I celler med overdreven autofagisk aktivering kan crocetin også redusere autofagi-flow og ekspresjon av mitofagirelaterte proteiner PINK1 og Parkin, og reversere overføringen av Parkin til mitokondrier. Crocetin kunne redusere H 2 O2-mediert oksidativ stressskade og apoptose av H9c2-celler, og dens mekanisme var nært knyttet til mitofagi.

Introduction

Akutt hjerteinfarkt (AMI) er en livstruende myokardnekrose forårsaket av alvorlig og vedvarende iskemi og hypoksi til koronararterier 1,2. Perkutan koronar intervensjon (PCI) er en av de første behandlingsstrategiene for akutt hjerteinfarkt, og beskytter vanligvis kardiomyocytter mot iskemisk skade 3,4. Det distale myokard vil mangle blod- og oksygenforsyning hvis det ikke behandles raskt og effektivt etter akutt hjerteinfarkt, noe som fører til iskemisk nekrose og ytterligere kardiovaskulære komplikasjoner 5,6. Å fremme kardiomyocyttutvinning og minimere irreversibel myokardskade etter å ha gått glipp av PCI-kirurgisk mulighet har vært et forskningspunkt. Etter AMI er kardiomyocytter i en tilstand av iskemi og hypoksi, noe som resulterer i inhibering av mitokondriell oksidativ fosforylering, reduksjon av NAD + til NADPH og økt enkelt elektronreduksjon7. Som et resultat genererer den ufullstendige reduksjonsreaksjonen av oksygen et overskudd av reaktive oksygenarter (ROS) og fører til slutt til oksidativ stressskade på kardiomyocytter8. En overdreven akkumulering av ROS utløser lipidperoksydasjon, noe som ytterligere forstyrrer strukturen og funksjonen til mitokondrielle membraner. Resultatet er en kontinuerlig åpning av mitokondriell permeabilitet overgangsporer og en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet, indusere apoptose og nekrose.

Angiotensinkonverterende enzym (ACE) hemmere, angiotensin-reseptorblokkere (ARB), hemmere av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister og andre standardmedikamenter i AMI kan bidra til å forbedre hjertefunksjonen etter hjerteinfarkt og forhindre forekomst av ondartede hendelser, som arytmier og venstre ventrikkel remodeling9. Overlevelse og prognose etter infarkt påvirkes imidlertid sterkt av infarktstørrelse, og tilfredsstillende resultater er ikke oppnådd for å redusere kardiomyocyttapoptose10,11. Dermed har utviklingen av medisiner for å fremme kardiomyocytgjenoppretting etter hjerteinfarkt blitt et presserende problem.

Tradisjonell medisin har vært en inspirasjonskilde for moderne farmasøytisk forskning i mange år12,13,14,15. Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har en lang historie i behandlingen av AMI, og en rekke randomiserte kontrollstudier de siste årene har bekreftet at TCM faktisk kan forbedre prognosen til pasienter16,17. Ifølge TCM-teorien er AMI forårsaket av blodstasis18,19, så medisiner for å fremme blodsirkulasjonen brukes vanligvis til behandling av AMI i den akutte fasen20. Blant dem antas safran å ha en kraftig effekt på blodaktivering og stasis, og brukes ofte i akutt behandling av AMI. Crocetin, en viktig komponent i safran, kan spille en nøkkelrolle i å beskytte kardiomyocytter21.

I denne studien ble H9c2 myokardceller indusert av H 2 O2for å simulere myokardiskemi / reperfusjon, som forårsaker en kardiomyocyttskade av AMI, og crocetin ble brukt som en intervensjon for å undersøke sin beskyttende effekt mot oksidativ stressindusert myokardskade. Mekanismen for krocetin som beskytter kardiomyocytter ble videre undersøkt gjennom mitofagi. Enda viktigere, denne artikkelen gir en referanse til den tekniske tilnærmingen til studiet av mitofagi og beskriver hele eksperimentell prosedyre i detalj.

Protocol

Forsøkene ble utført i laboratoriet for fysiologi ved Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alle studiemetoder ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter fra Beijing University. 1. Cellekultur Tilsett 10% føtal bovint serum og 1% penicillin / streptomycin til Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) basisk medium (med 4,5 g / L D-glukose, 4.g / L L-glutamin og 110 mg / L natriumpyruvat; se materialfortegnelse) for ?…

Representative Results

Effekter av crocetin på cellens levedyktighetCrocetin ved 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM og 100 μM hadde en signifikant proliferativ effekt på celler, mens crocetin i konsentrasjoner over 200 μM signifikant hemmet proliferasjonen av H9c2-celler (figur 1A). Etter 4 timers behandling med 400 μMH2O2ble cellens levedyktighet redusert betraktelig, og crocetin kunne til en viss grad reversere denne endringen (figu…

Discussion

Utforskningen av effektive ingredienser fra komplekse forbindelser av naturlige legemidler gjennom avansert teknologi har vært et hotspot for TCM-forskning29, og kan gi laboratoriebevis for fremtidig legemiddelutvikling etter verifisering. Safflower er et representativt stoff i behandlingen av “fremme blodsirkulasjon og minimere blodstasis” og er mye brukt i behandlingen av hjerteinfarkt30,31. Safran antas å ha lignende effekter som safl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) og National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetinPINK1/Parkin PathwayMitophagyROS DetectionMitochondrial Membrane PotentialTUNEL Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image