Basert på in vitro-eksperimenter avslørte denne studien crocetins mekanisme for å reparere oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å påvirke mitofagi, hvor PINK1 / Parkin-signalveien spiller en viktig rolle.
Denne studien hadde som mål å utforske den oksidative stressbeskyttende effekten av crocetin påH2O2-medierteH9c2-myokardceller gjennom in vitro-eksperimenter, og videre undersøke om mekanismen er relatert til virkningen av mitofagi. Denne studien hadde også som mål å demonstrere den terapeutiske effekten av saflorsyre på oksidativt stress i kardiomyocytter og undersøke om mekanismen er relatert til effekten av mitofagi. Her ble en H 2 O2-basertoksidativ stressmodell konstruert og vurdert graden av oksidativ stressskade av kardiomyocytter ved å oppdage nivåene av laktatdehydrogenase (LDH), kreatinkinase (CK), malondialdehyd (MDA), superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutationperoksidase (GSH Px). Reaktive oksygenarter (ROS)-detekterende fluorescerende fargestoff DCFH-DA, JC-1 fargestoff og TUNEL fargestoff ble brukt for å vurdere mitokondriell skade og apoptose. Autofagisk fluks ble målt ved transfeksjon av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitofagirelaterte proteiner ble deretter påvist via vestlig blotting og immunfluorescens. Imidlertid kan crocetin (0, 1-10 μM) forbedre cellens levedyktighet betydelig og redusere apoptose og oksidativ stressskade forårsaket avH 2 O2. I celler med overdreven autofagisk aktivering kan crocetin også redusere autofagi-flow og ekspresjon av mitofagirelaterte proteiner PINK1 og Parkin, og reversere overføringen av Parkin til mitokondrier. Crocetin kunne redusere H 2 O2-mediert oksidativ stressskade og apoptose av H9c2-celler, og dens mekanisme var nært knyttet til mitofagi.
Akutt hjerteinfarkt (AMI) er en livstruende myokardnekrose forårsaket av alvorlig og vedvarende iskemi og hypoksi til koronararterier 1,2. Perkutan koronar intervensjon (PCI) er en av de første behandlingsstrategiene for akutt hjerteinfarkt, og beskytter vanligvis kardiomyocytter mot iskemisk skade 3,4. Det distale myokard vil mangle blod- og oksygenforsyning hvis det ikke behandles raskt og effektivt etter akutt hjerteinfarkt, noe som fører til iskemisk nekrose og ytterligere kardiovaskulære komplikasjoner 5,6. Å fremme kardiomyocyttutvinning og minimere irreversibel myokardskade etter å ha gått glipp av PCI-kirurgisk mulighet har vært et forskningspunkt. Etter AMI er kardiomyocytter i en tilstand av iskemi og hypoksi, noe som resulterer i inhibering av mitokondriell oksidativ fosforylering, reduksjon av NAD + til NADPH og økt enkelt elektronreduksjon7. Som et resultat genererer den ufullstendige reduksjonsreaksjonen av oksygen et overskudd av reaktive oksygenarter (ROS) og fører til slutt til oksidativ stressskade på kardiomyocytter8. En overdreven akkumulering av ROS utløser lipidperoksydasjon, noe som ytterligere forstyrrer strukturen og funksjonen til mitokondrielle membraner. Resultatet er en kontinuerlig åpning av mitokondriell permeabilitet overgangsporer og en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet, indusere apoptose og nekrose.
Angiotensinkonverterende enzym (ACE) hemmere, angiotensin-reseptorblokkere (ARB), hemmere av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister og andre standardmedikamenter i AMI kan bidra til å forbedre hjertefunksjonen etter hjerteinfarkt og forhindre forekomst av ondartede hendelser, som arytmier og venstre ventrikkel remodeling9. Overlevelse og prognose etter infarkt påvirkes imidlertid sterkt av infarktstørrelse, og tilfredsstillende resultater er ikke oppnådd for å redusere kardiomyocyttapoptose10,11. Dermed har utviklingen av medisiner for å fremme kardiomyocytgjenoppretting etter hjerteinfarkt blitt et presserende problem.
Tradisjonell medisin har vært en inspirasjonskilde for moderne farmasøytisk forskning i mange år12,13,14,15. Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har en lang historie i behandlingen av AMI, og en rekke randomiserte kontrollstudier de siste årene har bekreftet at TCM faktisk kan forbedre prognosen til pasienter16,17. Ifølge TCM-teorien er AMI forårsaket av blodstasis18,19, så medisiner for å fremme blodsirkulasjonen brukes vanligvis til behandling av AMI i den akutte fasen20. Blant dem antas safran å ha en kraftig effekt på blodaktivering og stasis, og brukes ofte i akutt behandling av AMI. Crocetin, en viktig komponent i safran, kan spille en nøkkelrolle i å beskytte kardiomyocytter21.
I denne studien ble H9c2 myokardceller indusert av H 2 O2for å simulere myokardiskemi / reperfusjon, som forårsaker en kardiomyocyttskade av AMI, og crocetin ble brukt som en intervensjon for å undersøke sin beskyttende effekt mot oksidativ stressindusert myokardskade. Mekanismen for krocetin som beskytter kardiomyocytter ble videre undersøkt gjennom mitofagi. Enda viktigere, denne artikkelen gir en referanse til den tekniske tilnærmingen til studiet av mitofagi og beskriver hele eksperimentell prosedyre i detalj.
Utforskningen av effektive ingredienser fra komplekse forbindelser av naturlige legemidler gjennom avansert teknologi har vært et hotspot for TCM-forskning29, og kan gi laboratoriebevis for fremtidig legemiddelutvikling etter verifisering. Safflower er et representativt stoff i behandlingen av “fremme blodsirkulasjon og minimere blodstasis” og er mye brukt i behandlingen av hjerteinfarkt30,31. Safran antas å ha lignende effekter som safl…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (nr. 7202119) og National Natural Science Foundation of China (nr. 82274380).
0.25% trypsin | Gibco | 2323363 | |
1% Penicillin-streptomycin | Sigma | V900929 | |
5x protein loading buffer | Beijing Pulilai Gene Technology | B1030-5 | |
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus | Beyotime | C3011 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0514 | |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZF-0513 | |
Animal-free blocking solution | CST | 15019s | |
Anti-Parkin antibody | Santa Cruz | sc-32282 | |
Anti-PINK1 antibody | ABclonal | A11435 | |
Anti-TOM20 antibody | ABclonal | A19403 | |
Anti-β-actin antibody | ABclonal | AC026 | |
BCA protein assay kit | KeyGEN Biotech | KGP902 | |
Blood cell counting plate | Servicebio | WG607 | |
CAT assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1-1 | |
Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
CK assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A032-1-1 | |
Coenzyme Q10 (CoQ 10) | Macklin | C6129 | |
Crocetin | Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. | RFS-Z01802006012 | |
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZLI-9557 | |
DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
DMSO | Solarbio | D8371 | |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 8122091 | |
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution | NCM Biotech | P10100 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning-Cellgro | 35-081-CV | |
GraphPad Prism 7.0 | https://www.graphpad.com/ | ||
GSH-Px assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
H9c2 myocardial cells | Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. | CS0062 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit | LABLEAD | J22202 | |
LDH assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 | |
MDA assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-2-2 | |
Methanol | Aladdin | A2114057 | |
MTS assay | Promega | G3581 | |
Perhydrol | G-clone | CS7730 | |
Phosphatase inhibitor | CWBIO | CW2383 | |
Polybrene | Beyotime | C0351 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer | Solarbio | R0010 | |
SDS-PAGE gels | Shanghai Epizyme Biomedical Technology | PG112 | |
SDS-PAGE running buffer powder | Servicebio | G2018-1L | |
SDS-PAGE transfer buffer powder | Servicebio | G2017-1L | |
SOD assay kits | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-2-2 | |
Tris-buffered saline powder | Servicebio | G0001-2L | |
Triton X-100 | Sigma | SLCC9172 | |
TUNEL apoptosis assay kit | Beyotime | C1086 | |
Tween-20 | Solarbio | T8220 |