JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Skydd av H9c2-myokardceller från oxidativ stress av virketin via PINK1 / Parkin Pathway-medierad mitofagi

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65105
, , , , , ,
1School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital,Beijing University of Chinese Medicine

Summary

Baserat på in vitro-experiment avslöjade denna studie mekanismen för krocetin vid reparation av oxidativ stressskada av kardiomyocyter genom att påverka mitofagi, där PINK1 / Parkin-signalvägen spelar en viktig roll.

Abstract

Denna studie syftade till att undersöka den oxidativa stressskyddande effekten av krocetin påH2O2-medierade H9c2-myokardceller genom in vitro-experiment och ytterligare undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Denna studie syftade också till att visa den terapeutiska effekten av safflorsyra på oxidativ stress i kardiomyocyter och undersöka om dess mekanism är relaterad till effekten av mitofagi. Här konstruerades enH2O2-baseradoxidativ stressmodell och bedömde graden av oxidativ stressskada hos kardiomyocyter genom att detektera nivåerna av laktatdehydrogenas (LDH), kreatinkinas (CK), malondialdehyd (MDA), superoxiddismutas (SOD), katalas (CAT) och glutationperoxidas (GSH Px). Reaktiva syreradikaler (ROS)-detekterande fluorescerande färgämne DCFH-DA, JC-1-färgämne och TUNEL-färgämne användes för att bedöma mitokondriella skador och apoptos. Autofagiskt flöde mättes genom transfektering av Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-relaterade proteiner detekterades sedan via western blotting och immunofluorescens. Krocetin (0,1-10 μM) kan emellertid avsevärt förbättra cellviabiliteten och minska apoptos och oxidativ stressskada orsakad avH2O2. I celler med överdriven autofagisk aktivering kan krocetin också minska autofagiflödet och uttrycket av mitofagirelaterade proteiner PINK1 och Parkin och vända överföringen av Parkin till mitokondrier. Kroketin kunde minska H2O2-medierad oxidativ stressskada och apoptos av H9c2-celler, och dess mekanism var nära relaterad till mitofagi.

Introduction

Akut hjärtinfarkt (AMI) är en livshotande myokardinakros orsakad av svår och ihållande ischemi och hypoxi i kranskärlen 1,2. Perkutan koronar intervention (PCI) är en av de första linjens terapeutiska strategier för AMI och skyddar vanligtvis kardiomyocyter från ischemisk skada 3,4. Det distala myokardiet kommer att sakna blod- och syretillförsel om det inte behandlas snabbt och effektivt efter AMI, vilket leder till ischemisk nekros och ytterligare kardiovaskulära komplikationer 5,6. Att främja kardiomyocytåterhämtning och minimera irreversibel myokardskada efter att ha missat PCI-kirurgiska möjligheten har varit en forskningshotspot. Efter AMI är kardiomyocyter i ett tillstånd av ischemi och hypoxi, vilket resulterar i hämning av mitokondriell oxidativ fosforylering, reduktion av NAD + till NADPH och ökad enelektronreduktion7. Som ett resultat genererar den ofullständiga reduktionsreaktionen av syre ett överskott av reaktiva syrearter (ROS) och leder slutligen till oxidativ stressskada på kardiomyocyter8. En överdriven ackumulering av ROS utlöser lipidperoxidation, vilket ytterligare stör strukturen och funktionen hos mitokondriella membran. Resultatet är en kontinuerlig öppning av mitokondriella permeabilitetsövergångsporer och en minskning av mitokondriell membranpotential, inducerande apoptos och nekros.

Angiotensinkonverterande enzym (ACE) -hämmare, angiotensinreceptorblockerare (ARB), hämmare av β-adrenoceptorer, aldosteronantagonister och andra standardläkemedel i AMI kan bidra till att förbättra hjärtfunktionen efter hjärtinfarkt och förhindra förekomsten av maligna händelser, såsom arytmier och vänster ventrikulär remodellering9. Överlevnad och prognos efter infarkt påverkas dock kraftigt av infarktstorlek, och tillfredsställande resultat har inte uppnåtts för att minska kardiomyocytapoptos10,11. Således har utvecklingen av läkemedel för att främja kardiomyocytåterhämtning efter hjärtinfarkt blivit en brådskande fråga.

Traditionell medicin har varit en inspirationskälla för modern läkemedelsforskning i många år12,13,14,15. Traditionell kinesisk medicin (TCM) har en lång historia vid behandling av AMI, och en serie randomiserade kontrollstudier de senaste åren har bekräftat att TCM verkligen kan förbättra prognosen för patienter16,17. Enligt TCM-teorin orsakas AMI av blodstasis18,19, så läkemedel för att främja blodcirkulationen används vanligtvis för behandling av AMI i akut fas20. Bland dem tros saffran ha en kraftfull effekt på blodaktivering och stasis och används ofta vid akut behandling av AMI. Krocetin, en viktig komponent i saffran, kan spela en nyckelroll för att skydda kardiomyocyter21.

I denna studie inducerades H9c2-myokardceller avH2O2för att simulera myokardischemi / reperfusion, vilket orsakar en kardiomyocytskada av AMI, och kroketin användes som en intervention för att undersöka dess skyddande effekt mot oxidativ stressinducerad myokardskada. Mekanismen för krocetin som skyddar kardiomyocyter undersöktes ytterligare genom mitofagi. Ännu viktigare är att denna artikel ger en referens för det tekniska tillvägagångssättet för studier av mitofagi och beskriver hela experimentproceduren i detalj.

Protocol

Experimenten utfördes i fysiologilaboratoriet vid Beijing University of Chinese Medicine, Kina. Alla studiemetoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter från Peking University. 1. Cellodling Tillsätt 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin till Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) basmedium (med 4,5 g / L D-glukos, 4 g / L L-glutamin och 110 mg / L natriumpyruvat; se materialförteckning) för att f?…

Representative Results

Effekter av crocetin på cellviabilitetKroketin vid 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM och 100 μM hade en signifikant proliferativ effekt på celler, medan kroketin vid koncentrationer över 200 μM signifikant hämmade spridningen av H9c2-celler (figur 1A). Efter 4 timmars behandling med 400 μMH2O2minskade cellviabiliteten avsevärt och krocetin kunde vända denna förändring i viss utsträckning (figur 1B</stron…

Discussion

Utforskningen av effektiva ingredienser från komplexa föreningar av naturliga läkemedel genom avancerad teknik har varit en hotspot för TCM-forskning29 och kan ge laboratoriebevis för framtida läkemedelsutveckling efter verifiering. Safflor är ett representativt läkemedel vid behandling av “främjande av blodcirkulationen och minimering av blodstasis” och används ofta vid behandling av hjärtinfarkt30,31. Saffran tros ha liknande …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av Beijing Natural Science Foundation (nr 7202119) och National Natural Science Foundation of China (nr 82274380).

Materials

0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032 (2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253 (2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1 (2021).

Tags

Keywords: H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetinPINK1/Parkin PathwayMitophagyROS DetectionMitochondrial Membrane PotentialTUNEL Assay
check_url/65105?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, J., Li, Y., Zhang, Y., Du, T., Lu, Y., Li, X., Guo, S. Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy. J. Vis. Exp. (195), e65105, doi:10.3791/65105 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image