एरोमैटिक अमीनो एसिड द्वारा विनियमित सेल चयापचय की बायोऑर्थोगोनल रासायनिक इमेजिंग
Summary
हम ड्यूटेरियम-ऑक्साइड (भारी पानी डी2ओ) जांच किए गए उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अमीनो एसिड द्वारा विनियमित कोशिकाओं में चयापचय गतिविधियों को सीधे कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो दो-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2पीईएफ) के साथ एकीकृत है।
Abstract
आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (एएए) कोशिकाओं में नए बायोमास को संश्लेषित करने और सामान्य जैविक कार्यों को बनाए रखने के लिए निर्माण खंड हैं। उदाहरण के लिए, कैंसर कोशिकाओं के लिए उनके तेजी से विकास और विभाजन को बनाए रखने के लिए एएए की प्रचुर मात्रा में आपूर्ति महत्वपूर्ण है। इसके साथ, न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ एक अत्यधिक विशिष्ट, गैर-आक्रामक इमेजिंग दृष्टिकोण की बढ़ती मांग है ताकि सीधे कल्पना की जा सके कि कोशिकाएं अपने चयापचय के लिए एएए का उपयोग कैसे करती हैं। यहां, हम एक ऑप्टिकल इमेजिंग प्लेटफॉर्म विकसित करते हैं जो ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) को उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) के साथ जोड़ता है और डीओ-एसआरएस को दो-फोटॉन उत्तेजना फ्लोरेसेंस (2पीईएफ) के साथ एकल माइक्रोस्कोप में एकीकृत करता है ताकि एएए विनियमन के तहत हेला कोशिकाओं की चयापचय गतिविधियों को सीधे देखा जा सके। सामूहिक रूप से, डीओ-एसआरएस प्लेटफॉर्म एकल हेला सेल इकाइयों में नए संश्लेषित प्रोटीन और लिपिड की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और विशिष्टता प्रदान करता है। इसके अलावा, 2पीईएफ साधन एक लेबल-मुक्त तरीके से निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) और फ्लेविन के ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का पता लगा सकता है। यहां वर्णित इमेजिंग सिस्टम इन विट्रो और विवो मॉडल दोनों के साथ संगत है, जो विभिन्न प्रयोगों के लिए लचीला है। इस प्रोटोकॉल के सामान्य वर्कफ़्लो में सेल कल्चर, कल्चर मीडिया तैयारी, सेल सिंक्रनाइज़ेशन, सेल फिक्सेशन और डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ तौर-तरीकों के साथ नमूना इमेजिंग शामिल है।
Introduction
आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (एएए) होने के नाते, फेनिलएलनिन (पीएचई) और ट्रिप्टोफैन (ट्रिप) को मानव शरीर द्वारा सामान्यजैविक कार्यों को बनाए रखने के लिए नए अणुओं को संश्लेषित करने के लिए अवशोषित किया जा सकता है। प्रोटीन, मेलेनिन और टायरोसिन के संश्लेषण के लिए पीएचई की आवश्यकता होती है, जबकि मेलाटोनिन, सेरोटोनिन और नियासिन 2,3 के संश्लेषण के लिए ट्रिप की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन एएए की अधिक खपत रेपामाइसिन (एमटीओआर) मार्ग के स्तनधारी लक्ष्य को बढ़ा सकती है, एएमपी-सक्रिय प्रोटीन काइनेज को रोक सकती है, और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में हस्तक्षेप कर सकती है, सामूहिक रूप से मैक्रोमोलेक्यूल जैवसंश्लेषण को बदल सकती है औरस्वस्थ कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) जैसे घातक अग्रदूतों के उत्पादन की ओर अग्रसर हो सकती है।. कैंसर के विकास औरस्वस्थ कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा देने में एएए की भूमिकाओं को समझने के लिए अतिरिक्त एएए विनियमन के तहत परिवर्तित चयापचय गतिशीलता का प्रत्यक्ष दृश्य आवश्यक है।
पारंपरिक एएए अध्ययन गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) 10 पर भरोसा करते हैं। चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जैसे अन्य तरीकों में सीमित स्थानिक संकल्प होते हैं, जिससेजैविक नमूनों के सेलुलर और उप-सेलुलर विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। हाल ही में, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर प्रदूषक/आयनीकरण (माल्डी) विकसित किया गया है ताकि कैंसर प्रसार में लिपिड और प्रोटीन सिंथेसिस में एएए की भूमिका को स्पष्ट किया जा सके। हालांकि, यह तकनीक अभी भी उथले इमेजिंग गहराई, खराब स्थानिक संकल्प और व्यापक नमूना तैयारी से ग्रस्त है। सेलुलर स्तर पर, नॉनटॉक्सिक स्थिर आइसोटोप, जैसे नाइट्रोजन -15 और कार्बन -13, को मैक्रोमोलेक्यूल्स में उनके समावेश को समझने के लिए मल्टी-आइसोटोप इमेजिंग और नैनोस्केल सेकेंडरी आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ पता लगाया जा सकता है। हालांकि, ये विधियां जीवित जैविक नमूने15,16 के लिए विनाशकारी हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) एक और शक्तिशाली तकनीक है जो चयापचय गतिशीलता17 की कल्पना कर सकती है। दूसरी ओर, एएफएम इमेजिंग के दौरान स्कैनिंग की धीमी दर, थर्मल बहाव से परिणाम की छवि विरूपण का कारण बन सकती है।
हमने ड्यूटेरियम-ऑक्साइड (डी2ओ) को युग्मित करके एक नॉनइनवेसिव बाइऑर्थोगोनल इमेजिंग मोडिटी विकसित की, जो उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी और लेबल-फ्री टू-फोटॉन उत्तेजना फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (2पीईएफ) है। जैविक नमूने 18,19,20,21,22,23,24 इमेजिंग करते समय यह साधन एक उच्च स्थानिक संकल्प और रासायनिक विशिष्टता प्राप्त करता है। यह प्रोटोकॉल कैंसर की प्रगति के दौरान लिपिड, प्रोटीन और रेडॉक्स अनुपात परिवर्तनों की चयापचय गतिशीलता की जांच करने के लिए डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ के अनुप्रयोगों का परिचय देता है। डी2ओ पानी का एक स्थिर आइसोटोप रूप होने के साथ, सेलुलर बायोमोलेक्यूल्स को कोशिकाओं में कुल शरीर के पानी के साथ त्वरित मुआवजे के कारण ड्यूटेरियम (डी) के साथ लेबल किया जा सकता है, जो एंजाइमेटिक एक्सचेंज21 के माध्यम से कार्बन-ड्यूटेरियम (सी-डी) बॉन्ड बनाता है। नए संश्लेषित मैक्रोमोलेक्यूल्स में सी-डी बॉन्ड, जिसमें लिपिड, प्रोटीन, डीएनए / आरएनए और कार्बोहाइड्रेट शामिल हैं, रमन स्पेक्ट्रम20,21,22,25,26,27 के सेल साइलेंट क्षेत्र में पाए जा सकते हैं। दो सिंक्रनाइज़ लेजर दालों के साथ, नए संश्लेषित लिपिड और प्रोटीन के सी-डी बॉन्ड को साइटोटोक्सिक एजेंटों के साथ निकालने या लेबल किए बिना हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग (एचएसआई) के माध्यम से एकल कोशिकाओं पर प्रदर्शित किया जा सकता है। इसके अलावा, एसआरएस माइक्रोस्कोपी में क्रॉस-सेक्शनल छवियों22,26 के एक सेट को कैप्चर और संयोजन करके जैविक नमूनों में रुचि के चयनित क्षेत्रों के त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल बनाने की क्षमता है। हाइपरस्पेक्ट्रल और 3 डी वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के साथ, डीओ-एसआरएस एकल कोशिकाओं में नए संश्लेषित मैक्रोमोलेक्यूल्स के स्थानिक वितरण को प्राप्त कर सकता है, साथ ही ऑर्गेनेल के प्रकार के साथ जो एएए विनियमन22 के तहत कैंसर के विकास को बढ़ावा देने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, 2पीईएफ का उपयोग करके, हम जैविक नमूनों21,23,24 में उच्च रिज़ॉल्यूशन, गहरी प्रवेश गहराई और निम्न-स्तरीय क्षति के साथ फ्लेविन और निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) के ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल प्राप्त कर सकते हैं। फ्लेविन और एनएडीएच ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का उपयोग कैंसर कोशिकाओं22,26 में रेडॉक्स होमियोस्टैसिस और लिपिड पेरोक्सीडेशन को चिह्नित करने के लिए किया गया है। जैसे, न केवल डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ का युग्मन उच्च स्थानिक वितरण, रासायनिक विशिष्टता जानकारी और न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ कैंसर कोशिकाओं में एएए-विनियमित चयापचय गतिशीलता का उपकोशिकीय विश्लेषण प्रदान करता है, बल्कि विधि विषाक्त अभिकर्मकों के साथ अंतर्जात अणुओं को निकालने या लेबल करने की आवश्यकता को भी कम करती है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले डी2ओ और अमीनो एसिड तैयार करने की प्रक्रियाओं के साथ-साथ कैंसर सेल संस्कृति को प्रस्तुत करते हैं। फिर, हम डीओ-एसआरएस इमेजिंग और 2पीईएफ इमेजिंग के प्रोटोकॉल दिखाते हैं। अंत में, हम एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, जो लिपिड और प्रोटीन के एएए-विनियमित चयापचय परिवर्तन, और कैंसर कोशिकाओं में रेडॉक्स अनुपात परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। प्रक्रिया का एक विस्तृत चित्रण चित्र 1 में हाइलाइट किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला और मानव ऊतक 21,22,23,24,26,27,33 सहित विभिन्न पूर्व विवो मॉडल में चयापचय गतिशीलता की जांच करने के लिए डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ इमेज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
याजुआन ली और एंथनी फंग को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं, और सेल लाइन के लिए फ्रैली लैब। हम यूसीएसडी, एनआईएच U54CA132378, एनआईएच 5आर01एनएस111039, एनआईएच R21NS125395, NIHU54DK134301, एनआईएचयू 54 HL165443 और हेलमैन फेलो अवार्ड से स्टार्ट-अप फंड को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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