Denna artikel visar en standardiserad metod för att konstruera tredimensionella tumörsfäroider. En strategi för sfäroidobservation och bildbaserad djupinlärningsanalys med hjälp av ett automatiserat bildsystem beskrivs också.
Under de senaste decennierna har tredimensionella tumörsfäroider förutom monolagerodlade celler utvecklats som ett potentiellt kraftfullt verktyg för utvärdering av cancerläkemedel. De konventionella odlingsmetoderna saknar emellertid förmågan att manipulera tumörsfäroiderna på ett homogent sätt på tredimensionell nivå. För att ta itu med denna begränsning presenterar vi i detta dokument en bekväm och effektiv metod för att konstruera medelstora tumörsfäroider. Dessutom beskriver vi en metod för bildbaserad analys med hjälp av artificiell intelligensbaserad analysprogramvara som kan skanna hela plattan och få data om tredimensionella sfäroider. Flera parametrar studerades. Genom att använda en standardmetod för tumörsfäroidkonstruktion och ett bild- och analyssystem med hög genomströmning kan effektiviteten och noggrannheten hos läkemedelstester som utförs på tredimensionella sfäroider ökas dramatiskt.
Cancer är en av de sjukdomar som människor fruktar mest, inte minst på grund av dess höga dödlighet1. Under de senaste åren har möjligheten att behandla cancer ökat eftersom nya terapier har introducerats 2,3,4,5. Tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) in vitro-modeller används för att studera cancer i laboratoriemiljö. 2D-modeller kan emellertid inte omedelbart och exakt bedöma alla viktiga parametrar som indikerar antitumörkänslighet; Därför misslyckas de med att fullt ut representera in vivo-interaktioner vid läkemedelsbehandlingstestning6.
Sedan 2020 har den globala tredimensionella (3D) kulturmarknaden ökat kraftigt. Enligt en rapport från NASDAQ OMX kommer det globala värdet av 3D-cellodlingsmarknaden att överstiga 2,7 miljarder USD i slutet av 2025. Jämfört med 2D-odlingsmetoder uppvisar 3D-cellodling fördelaktiga egenskaper, som kan optimeras inte bara för spridning och differentiering utan också för långsiktig överlevnad 7,8. På så sätt kan cellulära mikromiljöer in vivo simuleras för att erhålla mer exakt tumörkarakterisering, såväl som metabolisk profilering, så att genomiska och proteinförändringar kan förstås bättre. På grund av detta bör 3D-testsystem nu inkluderas i den vanliga läkemedelsutvecklingsverksamheten, särskilt de med fokus på screening och utvärdering av nya antitumörläkemedel. Tredimensionella tillväxter av odödliggjorda etablerade cellinjer eller primära cellkulturer i sfäroidstrukturer har in vivo-egenskaper hos tumörer såsom hypoxi och läkemedelspenetration, såväl som cellinteraktion, respons och resistens, och kan betraktas som en strikt och representativ modell för att utföra in vitro-läkemedelsscreening 9,10,11.
Men dessa 3D-kulturmodeller lider också av flera problem som kan ta lite tid att lösa. Cellsfäroider kan bildas med hjälp av dessa protokoll, men de skiljer sig åt i vissa detaljer, såsom odlingstid eller inbäddning av geler12, så dessa konstruerade cellsfäroider kan inte kontrolleras väl under ett begränsat storleksintervall. Storleken på sfäroiderna kan påverka konsistensen av viabilitetstestet och avbildningsanalysen. Tillväxtmikromiljöerna och tillväxtfaktorerna varierar också, vilket kan leda till olika morfologier på grund av skillnader i differentieringen mellan celler13. Det finns nu ett uppenbart behov av en standardiserad, enkel och kostnadseffektiv metod för att konstruera alla typer av tumörer med kontrollerade storlekar.
Ur ett annat perspektiv, även om homogena analyser och avbildningsmetoder med högt innehåll har utvecklats för att utvärdera morfologi, livskraft och tillväxthastighet, är screening med hög genomströmning av 3D-modeller fortfarande en utmaning av olika skäl som rapporterats i litteraturen, såsom bristen på enhetlighet i positionen, storleken och morfologin hos tumörsfäroider14,15,16.
I protokollet som presenteras här listar vi varje steg i konstruktionen av 3D-tumörsfäroider och beskriver en metod för sfäroidobservation och analys med hjälp av ett bildsystem med hög genomströmning och högt innehåll som involverar autofokus, autoavbildning och analys, bland andra fördelaktiga egenskaper. Vi visar hur denna metod kan producera 3D-tumörsfäroider av enhetlig storlek som är lämpliga för avbildning med hög genomströmning. Dessa sfäroider visar också en hög känslighet för cancerläkemedelsbehandling, och morfologiska förändringar i sfäroiderna kan övervakas med hjälp av höginnehållsavbildning. Sammanfattningsvis demonstrerar vi robustheten i denna metod som ett sätt att generera 3D-tumörkonstruktioner för läkemedelsutvärdering.
Mikromiljön spelar en viktig roll i tumörtillväxt. Det kan påverka tillhandahållandet av extracellulära matriser, syregradienter, näring och mekanisk interaktion och därmed påverka genuttryck, signalvägar och många funktioner hos tumörceller 19,20,21. I många fall producerar 2D-celler inte sådana effekter eller till och med motsatta effekter, vilket påverkar utvärderingen av läkemedelsbehandlingar. Framväxten a…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i våra laboratorier för deras kritiska input och förslag. Denna forskning stöddes av nyckelprojektet för Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konceptualisering utfördes av C.W. och Z.C., metoden utfördes av W.H. och M.L., undersökningen utfördes av W.H. och M.L., datakureringen utfördes av W.H., Z.Z., S.X. och M.L., det ursprungliga utkastet till förberedelse utfördes av Z.Z., J.Z., S.X., W.H., och X.L., granskningen och redigeringen utfördes av Z.C., projektadministrationen utfördes av C.W. och Z.C. och finansieringsförvärvet genomfördes av C.W. Alla författare har läst och godkänt den publicerade versionen av manuskriptet.
0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
3D gel | Avatarget | MA02 | |
48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
DMSO | sigma | D2650-100ML | |
Excel sofware | Microsoft office | ||
Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
High Content Microscope and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
PBS | Solarbio | P1020 | |
Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |