Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera endogent tubulin från däggdjursceller, som kan sakna eller innehålla specifika mikrotubulimodifierande enzymer, för att erhålla mikrotubuli anrikade för en specifik modifiering. Vi beskriver sedan hur de extraherade mikrotubuli kan dekoreras med renade mikrotubulibindande proteiner för att förbereda galler för kryoelektronmikroskopi.
Mikrotubuli är en viktig del av cytoskelettet och är involverade i intracellulär organisation, celldelning och migration. Beroende på posttranslationella modifieringar kan mikrotubuli bilda komplex med olika interagerande proteiner. Dessa mikrotubuli-proteinkomplex är ofta inblandade i mänskliga sjukdomar. Att förstå strukturen hos sådana komplex är användbart för att belysa deras verkningsmekanismer och kan studeras med kryoelektronmikroskopi (kryo-EM). För att erhålla sådana komplex för strukturella studier är det viktigt att extrahera mikrotubuli som innehåller eller saknar specifika posttranslationella modifieringar. Här beskriver vi ett förenklat protokoll för att extrahera endogent tubulin från genetiskt modifierade däggdjursceller, vilket involverar mikrotubulipolymerisation, följt av sedimentering med ultracentrifugering. Det extraherade tubulinet kan sedan användas för att förbereda kryoelektronmikroskopgaller med mikrotubuli som är bundna till ett renat mikrotubulibindande protein av intresse. Som ett exempel demonstrerar vi extraktion av helt tyrosinerade mikrotubuli från cellinjer konstruerade för att sakna de tre kända tubulin-detyrosinerande enzymerna. Dessa mikrotubuli används sedan för att göra ett proteinkomplex med enzymatiskt inaktivt mikrotubuliassocierat tubulindetyrosinas på kryo-EM-galler.
Mikrotubuli är en viktig del av cytoskeletten; De är involverade i olika funktioner som cellmigration och delning men bidrar också till intracellulär organisation. För att anpassa sig till olika funktionella öden interagerar mikrotubuli med en mängd olika mikrotubuliassocierade proteiner (MAP), enzymer och andra proteiner, som vi kollektivt kommer att referera till som “mikrotubuli-interagerande proteiner”. Mikrotubulibindningen av dessa proteiner kan styras av olika tubulinmodifieringar, vanligen kallad “tubulinkoden”1. Exempel på denna preferens är det mitotiska centromerassocierade kinesin (MCAK)2 och dynein-dynaktinet CAP-Gly-domänen av p1503, som företrädesvis associeras med tyrosinerat tubulin, medan kinesinmotorernas centromerassocierade protein E (CENP-E)4 och kinesin-25 föredrar tubulin som saknar C-terminaltyrosin.
Medan en mängd olika metoder kan användas för att studera mikrotubuli-proteininteraktioner, används kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) ofta för att studera dessa interaktioner vid nästan atomär upplösning 6,7. Under de senaste åren har kryo-EM-strukturer avslöjat hur stora motorproteiner som dynein 8,9,10 och kinesin 11, +TIP-proteiner såsom EB312,13 och MCAK14, andra proteiner såsom Tau 15,16, och till och med små molekyler såsom paklitaxel, pelorusid och zampanolid 17 interagera med mikrotubuli. För att studera mikrotubuli-proteininteraktioner extraheras mikrotubuli typiskt från svinhjärnan18. Efter detta utförs de flesta in vitro-studier, inklusive kryo-EM-mikrotubulistrukturer, med användning av svinhjärntubulin. Resultaten av dessa studier döljer därför betydelsen av den heterogena karaktären av tubulinmodifieringar19 mellan vävnader och celltyper. Detta skapar ett särskilt problem när man undersöker ett protein som kräver eller föredrar en specifik modifiering för att binda till mikrotubuli. Detta kan illustreras med tyrosinerat tubulin, substratet för mikrotubulidetyrosinas MATCAP.
Detyrosination är en tubulinmodifiering där C-terminala aminosyratyrosin av α-tubulin saknas, vilket är associerat med mitotisk, hjärt- och neuronfunktion20. Medan helt tyrosinerade mikrotubuli är det perfekta substratet för MATCAP, saknas detta i stort sett i kommersiellt tillgängliga mikrotubuli från svinhjärnan på grund av funktionen av vasohibinerna 21,22 och MATCAP 23 detyrosinaser i denna vävnad 22,23,24,25,26. Även om kommersiellt tillgängligt HeLa-tubulin mestadels innehåller tyrosinerade mikrotubuli, kan detyrosination inträffa, och denna tubulinkälla är därför mindre lämplig för att skapa ett enhetligt prov för kryo-EM-analys.
För att stimulera bindningen av MATCAP till mikrotubuli och skapa ett homogent prov för strukturell analys sökte vi en källa till mikrotubuli som är helt tyrosinerad. För detta ändamål skapades en MATCAP och vasohibin-bristfällig cellinje, som användes för att extrahera helt tyrosinerade mikrotubuli. Extraktionsproceduren baserades på väletablerade protokoll som använder upprepade cykler av polymerisation och depolymerisation av mikrotubuli för att extrahera tubulin från hjärnvävnad eller celler 18,27,28,29,30, med endast ett enda polymerisationssteg och centrifugering över en glycerolkudde. Med MATCAP som exempel demonstrerar vi sedan hur dessa mikrotubuli kan användas för kryo-EM-studier. För att förbereda kryo-EM-nät beskrivs ett tvåstegs applikationsprotokoll vid låg saltkoncentration. Metoderna i detta dokument beskriver extraktionen av anpassningsbara mikrotubuli i tillräckliga mängder och renhet för att utföra kryo-EM-analys och ger ett detaljerat protokoll om hur man använder dessa mikrotubuli för att skapa protein-mikrotubulikomplex på kryo-EM-nät.
Denna metod beskriver hur man snabbt extraherar endogent tubulin från cellinjer och därefter dekorerar dessa mikrotubuli på kryo-EM-galler. Mikrotubuli är temperaturkänsliga. De depolymeriseras i en kall miljö och polymeriseras i en varm miljö31. Det är därför viktigt att utföra ultraljudsbehandling och clearance spinn (steg 1.1-1.5) vid 4 ° C för att solubilisera tubulin. Om några faktorer stabiliserade mikrotubuli så bra att de inte skulle depolymerisera i detta steg, skulle dessa mikrotubuli och de stabiliserande faktorerna kasseras i pelleten efter det första spelningsspinnet. Efter (åter)polymerisering av mikrotubuli är det viktigt att hålla lösningen som innehåller de polymeriserade mikrotubuli varm hela tiden. Vi extraherade mikrotubuli från HCT116-celler, som är bristfälliga i VASH1-, VASH2- och MATCAP-proteinerna. Andra cellinjer, såväl som vävnader, kan användas för att extrahera mikrotubuli29, även om föroreningarna, tubulinisotyperna och utbytet kan skilja sig mycket från vad som beskrivs här. Överuttryckande plasmider som innehåller modifierande enzymer kan också användas för att införa specifika tubulinmodifieringar.
Andra protokoll 18,27,28,29,30 använder flera cykler av polymerisation och depolymerisation av mikrotubuli för att erhålla mikrotubuli utan andra interagerande proteiner. Här har vi förenklat dessa protokoll och polymeriserar bara mikrotubuli en gång. Det är möjligt att på grund av denna enda polymerisation kan dessa mikrotubuli samsedimentera med andra mikrotubuli-interagerande proteiner. Vi har dock funnit att detta protokoll ger tillräckligt rena mikrotubuli för kryo-EM-ändamål. Om ett renare prov behövs för specifika analyser kan ytterligare cykler av polymerisation och depolymerisation ge ett renare prov, även om detta kan vara på bekostnad av mikrotubuliutbytet. I detta protokoll använde vi paklitaxel för att polymerisera mikrotubuli. Paklitaxel kan emellertid förvrida mikrotubuligitteret mot en viss vridning och höjning, vilket kan störa mikrotubuliaffiniteten hos proteinet av intresse. Andra mikrotubulistabiliserande reagens kan användas om paklitaxel är olämpligt. Exempel på dessa reagens är icke-taxanmolekyler såsom pelorusid eller icke-hydrolyserbara GTP-varianter såsom GMPCPP17,32.
För att strukturellt undersöka proteiner som binder till mikrotubuli på kryo-EM-galler måste man binda en tillräcklig mängd av proteinet av intresse för mikrotubuli. Ett vanligt förekommande problem är att proteinkomplex som är stabila i lösning faller sönder på gallret. För att bilda proteinkomplexet på gallret var det avgörande att först skikta mikrotubuli och sedan applicera det mikrotubulibindande proteinet med låg saltkoncentration på det mikrotubulibelagda gallret och därmed montera proteinkomplexet direkt på gallret. Andra har på liknande sätt rapporterat ett 33,34-protokoll med låg salthalt och ett tvåstegsprotokoll 34,35,36 för framgångsrik mikrotubulidekoration. Det är troligt att en lägre saltkoncentration förspänder proteinkomplexet mot en mer stabil interaktion på grund av de minskade elektrostatiska laddningarna. På grund av den låga saltkoncentrationen riskerar emellertid proteinet av intresse för utfällning. Därför rekommenderas det starkt att hålla proteinet vid eller runt fysiologiskt relevanta saltkoncentrationer tills strax innan gallret förglasas. Detta tvåstegsapplikationsprotokoll förhindrar sannolikt att proteinkomplexet faller sönder under blottnings- eller doppfrysningsstegen. I detta protokoll använde vi Vitrobot. Snabbare vitrifieringsmetoder (VitroJet) eller användning av fläckfria galler (Puffalot) eller enheter som har båda egenskaperna (kameleont) kan dock potentiellt övervinna tvåstegsapplikationen, men dessa är för närvarande inte allmänt tillgängliga för testning.
Den slutliga upplösningen av den rekonstruerade kryo-EM-densiteten kan påverkas av ett antal faktorer, inklusive rörelsen av det mikrotubulibindande proteinet i förhållande till mikrotubuli och den dekorationsnivå som kan uppnås. Högre mikrotubulär dekoration är sannolikt fördelaktig för den slutliga upplösningen som erhållits i 3D-densitetsrekonstruktionen. Detta kan begränsas av några faktorer, såsom den högsta proteinkoncentrationen som erhålls under reningen av det mikrotubulibindande proteinet, den lägsta saltkoncentrationen som det mikrotubuli-interagerande proteinet kan motstå utan att aggregera och bindningsläget för det mikrotubuli-interagerande proteinet (t.ex. proteinet kan spänna över mer än en tubulindimer, vilket hindrar ett bindningsförhållande 1: 1). Även om upplösningen av kryo-EM-rekonstruktionen kan äventyras av glest dekorerade mikrotubuli, kan beräkningsanalys kringgå många problem, vilket exemplifieras av en nyligen rapporterad mikrotubuli-proteinkomplex struktur som var extremt glest dekorerad8.
Protokollet vi beskriver här presenterar en snabb, billig metod för att erhålla mikrotubuli lämpliga för kryo-EM-ändamål. I motsats till kommersiellt tillgängligt hjärntubuli hos svin är mikrotubuli härrörande från MATCAP-bristfälliga och vasohibinbristfälliga HCT116-celler helt tyrosinerade (figur 4). Kommersiellt HeLa-tubulin, ett dyrt reagens, är i princip relativt enhetligt tyrosinerat och innehåller lite andra modifieringar4 såsom glutamylering, men satser kan variera och modifiering kan endast uppnås in vitro. En fördel med att extrahera mikrotubuli från skräddarsydda cellinjer är flexibiliteten man har att överuttrycka eller ta bort tubulinmodifierande enzymer, såsom tubulindetyrosinaser, för att skapa en mer homogen pool av mikrotubuli. Detta kan gynna dekorationen och enhetligheten hos kryo-EM-provet och kommer i slutändan att gynna enkelheten och kvaliteten på kryo-EM-densitetskartorna och molekylstrukturerna härledda från detta prov.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Sixma-, Brummelkamp- och Perrakis-grupperna för deras givande vetenskapliga diskussioner och för att ge en trevlig arbetsmiljö, och särskilt tackar vi Jan Sakoltchik (“person 2”) för att hjälpa till att bestämma proteinkoncentrationen som visas i figur 3C. Vi vill också tacka NKI cryo-EM-anläggningen och Netherlands Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN) vid Leiden University för deras stöd. Detta arbete stöddes av NWO Vici-bidrag 016.Vici.170.033 som tilldelades T.R.B.. AP och T.R.B. är Oncode-utredare och får finansiering från NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. fick finansiering från den österrikiska vetenskapsfonden (FWF JB4448-B). Denna forskning stöddes av ett institutionellt bidrag från det nederländska cancerförbundet och det nederländska ministeriet för hälsa, välfärd och idrott.
Material | |||
0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
Equipment | |||
Flow hood | cell culture | ||
GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
Water bath | cell culture |