Denne protokol beskriver mikroinjektion og in vivo-elektroporation til regionalt begrænset CRISPR-medieret genomredigering i museovidukten.
Germline genetisk manipulerede musemodeller (G-GEMM’er) har givet værdifuld indsigt i in vivo genfunktion i udvikling, homeostase og sygdom. Imidlertid er tiden og omkostningerne forbundet med kolonioprettelse og vedligeholdelse høje. Nylige fremskridt inden for CRISPR-medieret genomredigering har gjort det muligt at generere somatiske GEMM’er (S-GEMM’er) ved direkte at målrette mod cellen / vævet / organet af interesse.
Ovidukten eller æggelederen hos mennesker betragtes som oprindelsesvævet for den mest almindelige kræft i æggestokkene, højkvalitets serøse ovariekarcinomer (HGSC’er). HGSC’er initierer i æggelederens område distalt til livmoderen, der ligger ved siden af æggestokken, men ikke det proksimale æggeleder. Imidlertid er traditionelle musemodeller af HGSC målrettet mod hele ovidukten og rekapitulerer således ikke den menneskelige tilstand. Vi præsenterer en metode til mikroinjektion af DNA-, RNA- eller ribonukleoprotein (RNP) opløsning i oviduktlumen og in vivo-elektroporation for at målrette slimhindepitelceller i begrænsede områder langs ovidukten. Der er flere fordele ved denne metode til kræftmodellering, såsom 1) høj tilpasningsevne i målretning af området / væv / organ og elektroporationsområdet, 2) høj fleksibilitet i målrettede celletyper (cellulær plians), når de anvendes i kombination med specifikke promotorer til Cas9-ekspression, 3) høj fleksibilitet i antallet af elektroporerede celler (relativt lav frekvens), 4) der kræves ingen specifik muselinje (immunkompetent sygdomsmodellering), 5) høj fleksibilitet i genmutationskombination og 6) mulighed for at spore elektroporerede celler, når de anvendes i kombination med en Cre-reporterlinje. Således rekapitulerer denne omkostningseffektive metode human kræftinitiering.
Æggelederen, kaldet ovidukten hos mus, er en rørformet struktur, der forbinder livmoderen med æggestokken. Det spiller en væsentlig rolle i pattedyrs reproduktion og giver miljøet til intern befrugtning og præimplantationsudvikling 1,2. På trods af dets betydning er der lidt kendt om dets funktion og homeostase, dels på grund af udviklingen af in vitro-befrugtningsteknikker, der omgår ethvert infertilitetsproblem relateret til dette organ3. Det er imidlertid blevet anerkendt, at precancerøse læsioner af højkvalitets serøst ovariekarcinom (HGSC), en aggressiv histotype af kræft i æggestokkene, der tegner sig for omkring 75% af ovariekarcinomer og 85% af relaterede dødsfald4, er begrænset til det distale æggelederepitel 5,6,7,8 . Dette indikerer, at ikke alle celler i vores krop er lige modtagelige for onkogene fornærmelser, men snarere kun unikke / modtagelige celler i hvert væv / organ bliver oprindelsescellen i kræft – kaldet cellulær pliancy9. På denne måde har det vist sig, at epitelcellerne i det distale æggeleder, der ligger ved siden af æggestokken, adskiller sig fra resten af røret10,11. Således rekapitulerer traditionelle musemodeller af HGSC, der er målrettet mod alle celler i ovidukten, ikke den menneskelige tilstand. I en nylig undersøgelse brugte vi en kombination af CRISPR-medieret genomredigering, in vivo oviduktelektroporation og Cre-baseret afstamningssporing til succesfuldt at inducere HGSC ved at mutere fire tumorsuppressorgener i den distale museovidukt12,13. Dette manuskript præsenterer en trin-for-trin protokol, der beskriver denne procedure for mikroinjektion og in vivo elektroporation for at målrette museoviduktens slimhindepitel.
Denne metode har flere fordele. Det kan tilpasses til at målrette mod andre væv / organer, herunder organparenkym14. Selvom andre in vivo-genleveringsmetoder som lentivirale og adenovirale systemer kan bruges til at opnå lignende vævs- / organspecifik målretning, justeres målretningsområdet lettere ved hjælp af forskellige størrelser pincetelektroder til elektroporationsbaseret levering. Afhængigt af koncentrationen af DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP’er), elektroporationsparametre og elektrodernes størrelse kan antallet af elektroporerede celler ændres. Desuden kan specifikke celletyper målrettes, når de anvendes i kombination med promotorer til Cas9-ekspression uden det absolutte behov for Germline genetisk manipulerede musemodeller (G-GEMM’er). Derudover tillader elektroporation i modsætning til virale leveringssystemer multipel plasmidlevering i enkeltceller og mindre begrænsning i insert-DNA-størrelsen15. In vivo-screening af genmutationer kan også udføres relativt let på grund af denne høje fleksibilitet. Endvidere kan elektroporerede celler spores eller spores, når denne metode anvendes i kombination med Cre-reporterlinjer såsom Tdtomato eller Confetti16,17.
Afgørende trin i denne detaljerede protokol er mikroinjektion af DNA / RNA / RNP-opløsning i oviduktlumen og kontrol af elektroporationsstyrken og arealet. Lækage af DNA/RNA/RNP-opløsning under mikroinjektion kan forårsage transfektion af uønskede områder/celler. For ensartet og effektiv elektroporation foretrækkes det at fylde oviduktens lumen med opløsningen (figur 3C, D). Dette skyldes, at elektroporationsområdet hovedsageligt styres af elektrodestørrelse og placering. Svag elektroporation reducerer antallet af elektroporerede celler, og hård elektroporation kan forårsage elektroporation af uønskede celler eller forstyrre vævsstrukturen. Antallet af elektroporerede celler kan varieres ved at justere DNA/RNA/RNP-opløsningskoncentrationen eller elektroporationsparametrene. Da højspænding/varmeproduktion under elektroporation imidlertid kan beskadige vævet, bør disse parametre testes før brug på levende/bedøvede mus. Endelig anbefales det på grund af den krævende karakter af denne procedure at øve kanaleksponering og mikroinjektion på døde mus, inden denne operation udføres på levende / bedøvede mus.
Det erkendes, at flere gener er involveret i kræftinitiering, og derfor kræver rekapitulering af denne begivenhed multiallelisk modifikation af flere gener. Derudover er det også kendt, at ikke alle celler er lige modtagelige for onkogene mutationer9. Kræftmodellering kræver derfor specifikke Cre-muselinjer for at opnå stram kontrol med onkogene fornærmelser. Deres tilgængelighed og specificitet forårsager imidlertid forskellige udfordringer, herunder virkninger i ikkemålvæv og dødelighed19. Desuden medfører traditionelle G-GEMM’er høje omkostninger til vedligeholdelse og kræver tid til generering af muselinjer. Udviklingen af CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi og forbedring af genlevering til specifikke somatiske celler har gjort det muligt for os at overvinde disse problemer. I denne protokol præsenterer vi en DNA/RNA/RNP-leveringsmetode til somatisk genommanipulation, der kan bruges til kræftmodellering uden det absolutte behov for specifikke muselinjer12. Ved at injicere DNA/RNA/RNP-opløsninger i lumen og anvende forskellige størrelser pincetelektroder til elektroporationsbaseret levering målrettes begrænsede områder af museoviduktens slimhindepitel (figur 4A-F). Dette er især nyttigt til modellering af initieringen af HGSC’er, der stammer fra den distale ende af æggelederen.
Den præsenterede mikroinjektions- og in vivo-elektroporationsmetode er meget alsidig til målretning af væv / organer med et lumen. Orgelparenkym kan også målrettes ved hjælp af denne metode14. Virale leveringsmetoder, som lentivirale og adenovirale systemer, kan også bruges til lignende formål. Fordelene ved elektroporation i forhold til virale leveringsmetoder er imidlertid: 1) multipel plasmidlevering i enkeltceller, 2) ingen begrænsning af indsatsstørrelsen15 og 3) nem kontrol af området og leveringstidspunktet. Derudover kan målretningsspecificitet forbedres ved at bruge afstamningsspecifikke promotorer. Dette er undertiden vanskeligt i virale systemer på grund af grænsen for viral emballage.
Som det er karakteren af elektroporation, er elektroporerede epitelceller tilfældigt blandet med sunde, uredigerede celler (figur 4G). Denne mosaik i genetisk modificerede og umodificerede celler kan imidlertid være en fordel for at studere kræftinitiering, da den rekapitulerer den sporadiske karakter af tidlig kræftinitiering inden for et immunkompetent mikromiljø. Frekvensen af elektroporerede celler kan justeres ved at variere DNA/RNA/RNP-opløsningskoncentrationerne og/eller elektroporationsparametrene. Ved hjælp af CRISPR-Cas-medieret genredigering i kombination med den præsenterede protokol er det let at screene flere gener og generere heterogene mønstre af mutationer / allelkombinationer i målrettede gener; dette er især nyttigt ved modellering af kræftformer, der præsenterer et betydeligt antal genomiske ændringer som HGSC’er20,21. Ved at sekventere målrettede gener under kræftprogression er det desuden muligt at følge in vivo klonal udvikling af tumorer og metastaser i immunkompetente mus12.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Katie Teng og Dr. Matthew J. Ford for at levere plasmider, der bruges til at generere repræsentative resultater og protokoloptimering. K.H. blev støttet af Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS) ph.d.-stipendium, Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Center for Forskning i Reproduktion og Udvikling (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin og Alexander McFee kandidatstuderende.
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |