Detta protokoll beskriver mikroinjektion och in vivo-elektroporering för regionalt begränsad CRISPR-medierad genomredigering i musovidukten.
Germline genetiskt modifierade musmodeller (G-GEMM) har gett värdefull insikt i in vivo-genfunktion vid utveckling, homeostas och sjukdom. Tiden och kostnaden för att skapa och underhålla kolonier är dock hög. De senaste framstegen inom CRISPR-medierad genomredigering har möjliggjort generering av somatiska GEMM (S-GEMM) genom att direkt rikta in sig på cellen / vävnaden / organet av intresse.
Äggledaren, eller äggledaren hos människor, anses vara ursprungsvävnaden för den vanligaste äggstockscancern, högkvalitativa serösa äggstockscancer (HGSC). HGSC initierar i äggledarens område distalt mot livmodern, som ligger intill äggstocken, men inte det proximala äggledaren. Traditionella musmodeller av HGSC riktar sig emellertid mot hela äggledaren och rekapitulerar därför inte det mänskliga tillståndet. Vi presenterar en metod för DNA-, RNA- eller ribonukleoproteinlösning (RNP) lösning mikroinjektion i oviduktlumen och in vivo elektroporering för att rikta mukosala epitelceller i begränsade regioner längs äggledaren. Det finns flera fördelar med denna metod för cancermodellering, såsom 1) hög anpassningsförmåga vid inriktning på området / vävnaden / organet och regionen för elektroporering, 2) hög flexibilitet i riktade celltyper (cellulär smidighet) när den används i kombination med specifika promotorer för Cas9-uttryck, 3) hög flexibilitet i antalet elektroporerade celler (relativt låg frekvens), 4) ingen specifik muslinje krävs (immunokompetent sjukdomsmodellering), 5) hög flexibilitet i genmutationskombination, och 6) möjlighet att spåra elektroporerade celler när de används i kombination med en Cre-rapportlinje. Således rekapitulerar denna kostnadseffektiva metod mänsklig cancerinitiering.
Äggledaren, kallad ovidukten hos möss, är en rörformig struktur som förbinder livmodern med äggstocken. Det spelar en viktig roll i däggdjurens reproduktion och ger miljön för intern befruktning och preimplantatorisk utveckling 1,2. Trots dess betydelse är lite känt om dess funktion och homeostas, delvis på grund av utvecklingen av in vitro-fertiliseringstekniker som kringgår eventuella infertilitetsproblem relaterade till detta organ3. Det har emellertid erkänts att precancerösa lesioner av högkvalitativt seröst äggstockscancer (HGSC), en aggressiv histotyp av äggstockscancer som står för cirka 75% av äggstockscancer och 85% av relaterade dödsfall4, är begränsade till det distala äggledarepitelet 5,6,7,8 . Detta indikerar att inte alla celler i vår kropp är lika mottagliga för onkogena förolämpningar, utan snarare bara unika / mottagliga celler i varje vävnad / organ blir ursprungscellen i cancer – kallad cellulär pliancy9. I linje med detta har det visats att epitelcellerna i det distala äggledaren, som ligger intill äggstocken, skiljer sig från resten av röret10,11. Således rekapitulerar traditionella musmodeller av HGSC, som riktar sig mot alla celler i äggledaren, inte det mänskliga tillståndet. I en nyligen genomförd studie använde vi en kombination av CRISPR-medierad genomredigering, in vivo oviduktelektroporering och Cre-baserad härstamningsspårning för att framgångsrikt inducera HGSC genom att mutera fyra tumörsuppressorgener i den distala musovidukten12,13. Detta manuskript presenterar ett steg-för-steg-protokoll som beskriver denna procedur för mikroinjektion och in vivo-elektroporering för att rikta in sig på musens oviduktslemhinneepitel.
Denna metod har flera fördelar. Det kan anpassas för att rikta in sig på andra vävnader / organ, inklusive organparenkym14. Även om andra in vivo-genleveransmetoder som lentivirala och adenovirala system kan användas för att uppnå liknande vävnads-/organspecifik inriktning, justeras målområdet lättare med hjälp av olika storlekar av pincettelektroder för elektroporationsbaserad leverans. Beroende på koncentrationen av DNA / RNA / ribonukleoproteiner (RNP), elektroporeringsparametrar och elektrodernas storlek kan antalet elektroporerade celler ändras. Vidare kan specifika celltyper riktas när de används i kombination med promotorer för Cas9-uttryck, utan det absoluta behovet av Germline genetiskt modifierade musmodeller (G-GEMM). Dessutom, till skillnad från virala leveranssystem, möjliggör elektroporering multipel plasmidleverans till enskilda celler och mindre begränsning i insats-DNA-storlek15. In vivo-screening av genmutationer kan också utföras relativt enkelt på grund av denna höga flexibilitet. Vidare kan elektroporerade celler spåras eller spåras när denna metod används i kombination med Cre-reporterlinjer som Tdtomato eller Confetti16,17.
Avgörande steg i detta detaljerade protokoll är mikroinjektion av DNA / RNA / RNP-lösning i oviduktlumen och kontroll av elektroporeringsstyrkan och området. DNA/RNA/RNP-lösningsläckage under mikroinjektion kan orsaka transfektion av oönskade områden/celler. För konsekvent och effektiv elektroporering är det att föredra att fylla oviduktlumen med lösningen (figur 3C, D). Detta beror på att elektroporeringsområdet huvudsakligen styrs av elektrodstorlek och placering. Svag elektroporering minskar antalet elektroporerade celler, och hård elektroporering kan orsaka elektroporering av oönskade celler eller störa vävnadsstrukturen. Antalet elektroporerade celler kan varieras genom att justera DNA / RNA / RNP-lösningskoncentrationen eller elektroporeringsparametrarna. Men eftersom höga spänningar/värmeproduktion under elektroporering kan skada vävnaden, bör dessa parametrar testas före användning på levande/bedövade möss. Slutligen, på grund av den krävande karaktären av denna procedur, rekommenderas det att öva exponering i tarmkanalen och mikroinjektion på döda möss innan du utför denna operation på levande / bedövade möss.
Det är erkänt att flera gener är involverade i cancerinitiering, så rekapitulering av denna händelse kräver multiallelisk modifiering av flera gener. Dessutom är det också känt att inte alla celler är lika mottagliga för onkogena mutationer9. Cancermodellering kräver därför specifika Cre-muslinjer för att uppnå tät kontroll av onkogena förolämpningar. Deras tillgänglighet och specificitet orsakar dock olika utmaningar, bland annat effekter i vävnader som inte är måltavlor och dödlighet19. Dessutom medför traditionella G-GEM höga kostnader för underhåll och kräver tid för generering av muslinjer. Utvecklingen av CRISPR / Cas9 genomredigeringsteknik och förbättring av genleverans till specifika somatiska celler har gjort det möjligt för oss att övervinna dessa problem. I detta protokoll presenterar vi en DNA/RNA/RNP-leveransmetod för somatisk genommanipulation som kan användas för cancermodellering, utan det absoluta behovet av specifika muslinjer12. Genom att injicera DNA / RNA / RNP-lösningar i lumen och använda olika storlekar av pincetttypelektroder för elektroporeringsbaserad leverans, riktas begränsade områden av musens oviduktslemhinneepitel (figur 4A-F). Detta är särskilt användbart vid modellering av initiering av HGSC som härrör från den distala änden av äggledaren.
Den presenterade mikroinjektions- och in vivo-elektroporeringsmetoden är mycket mångsidig för att rikta vävnader / organ med en lumen. Orgelparenkym är också måltavla med denna metod14. Virala leveransmetoder, som lentivirala och adenovirala system, kan också användas för liknande ändamål. Fördelarna med elektroporering jämfört med virala leveransmetoder är dock: 1) multipel plasmidleverans till enskilda celler, 2) ingen begränsning av skärstorleken15 och 3) enkel kontroll av området och tidpunkten för leverans. Dessutom kan inriktningsspecificiteten förbättras genom att använda härstamningsspecifika promotorer. Detta är ibland svårt i virala system på grund av gränsen för virusförpackningar.
Liksom elektroporeringens natur är elektroporerade epitelceller slumpmässigt isär med friska, oredigerade celler (figur 4G). Denna mosaik i genetiskt modifierade och omodifierade celler kan dock vara fördelaktig för att studera cancerinitiering, eftersom den rekapitulerar den sporadiska karaktären av tidig cancerinitiering inom en immunkompetent mikromiljö. Frekvensen av elektroporerade celler kan justeras genom att variera DNA / RNA / RNP-lösningskoncentrationerna och / eller elektroporeringsparametrarna. Med hjälp av CRISPR-Cas-medierad genredigering i kombination med det presenterade protokollet är det enkelt att screena flera gener och generera heterogena mönster av mutationer / allelkombinationer i riktade gener; Detta är särskilt användbart vid modellering av cancer som uppvisar ett stort antal genomiska förändringar som HGSC20,21. Genom att sekvensera riktade gener under cancerprogression är det dessutom möjligt att följa den klonala utvecklingen in vivo av tumörer och metastaser hos immunkompetenta möss12.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Katie Teng och Dr. Matthew J. Ford för att tillhandahålla plasmider som används för att generera representativa resultat och protokolloptimering. K.H. stöddes av doktorandstipendiet Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS), Donnor Foundation, Delta Kappa Gamma World Fellowship, Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande &; Marcel Gosselin och Alexander McFee doktorander.
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |