Bananflugan (Drosophila melanogaster) används ofta för biologisk och toxikologisk forskning. För att utöka nyttan av flugor utvecklade vi ett instrument, serial anesthesia array, som samtidigt exponerar flera flugprover för flyktiga allmänanestetika (VGA), vilket gör det möjligt att undersöka kollaterala effekter (toxiska och skyddande) av VGA.
Flyktiga narkosmedel (VGA) används över hela världen på miljontals människor i alla åldrar och medicinska tillstånd. Höga koncentrationer av VGA (hundratals mikromolära till låga millimolar) är nödvändiga för att uppnå en djup och ofysiologisk undertryckning av hjärnans funktion som presenteras som “anestesi” för observatören. Hela spektrumet av de säkerhetseffekter som utlöses av sådana höga koncentrationer av lipofila medel är inte känt, men interaktioner med det immuninflammatoriska systemet har noterats, även om deras biologiska betydelse inte förstås.
För att undersöka de biologiska effekterna av VGA hos djur utvecklade vi ett system som kallas serial anesthesia array (SAA) för att utnyttja de experimentella fördelarna med bananflugan (Drosophila melanogaster). SAA består av åtta kammare arrangerade i serie och anslutna till ett gemensamt inflöde. Vissa delar finns i labbet, och andra kan enkelt tillverkas eller köpas. En vaporizer, som är nödvändig för kalibrerad administrering av VGA, är den enda kommersiellt tillverkade komponenten. VGA utgör endast en liten andel av atmosfären som strömmar genom SAA under drift, eftersom huvuddelen (vanligtvis över 95%) är bärgas; Standardbäraren är Air. Syre och andra gaser kan dock undersökas.
SAA: s främsta fördel jämfört med tidigare system är att det tillåter samtidig exponering av flera kohorter av flugor till exakt titrerbara doser av VGA. Identiska koncentrationer av VGA uppnås inom några minuter i alla kamrar, vilket ger oskiljbara experimentella förhållanden. Varje kammare kan innehålla från en enda fluga till hundratals flugor. Till exempel kan SAA samtidigt undersöka åtta olika genotyper eller fyra genotyper med olika biologiska variabler (t.ex. man mot kvinna, gammal mot ung). Vi har använt SAA för att undersöka farmakodynamiken hos VGA och deras farmakogenetiska interaktioner i två experimentella flugmodeller associerade med neuroinflammation-mitokondriella mutanter och traumatisk hjärnskada (TBI).
Förekomsten av kollaterala bedövningseffekter (dvs. effekter som inte är omedelbart observerbara men kan ha fördröjda beteendemässiga konsekvenser) är allmänt accepterad, men förståelsen av deras mekanismer och riskfaktorer förblir rudimentär 1,2. Deras fördröjda manifestation och subtilitet begränsar antalet potentiellt viktiga variabler som kan undersökas i däggdjursmodeller inom rimliga tidsramar och till en acceptabel kostnad. Bananflugan (Drosophila melanogaster) erbjuder unika fördelar i samband med neurodegenerativ sjukdom3 och för toxikologisk screening4 som hittills inte har tillämpats på studier av anestetiska sidoeffekter.
Vi utvecklade SAA (serial anesthesia array) för att underlätta användningen av bananflugor i studiet av anestesifarmakodynamik och farmakogenetik. En viktig fördel med SAA är samtidig exponering för identiska experimentella förhållanden för flera kohorter. I kombination med den experimentella flexibiliteten hos bananflugor möjliggör SAA: s höga genomströmning utforskning av biologiska och miljömässiga variabler i en skala som är omöjlig i däggdjursmodeller.
I princip är SAA helt enkelt en serie anslutna bedövningsplatser (kammare gjorda av 50 ml injektionsflaskor) genom vilka en bärgas levererar flyktiga ämnen. Systemets första kammare innehåller destillerat vatten genom vilket bärgasen fuktas (flugor är känsliga för uttorkning) och avslutas med en enkel flödesindikator som indikerar gasflödet genom systemet. Fina nät placerade på anslutningsslangens öppningar separerar kamrarna för att förhindra migrering av flugor mellan kamrarna. Antalet platser “i serie” begränsas av motståndet mot det trycklösa gasflödet (slangar, nät).
Vi karakteriserade kinetiken för denna SAA-prototyp i en tidigare publikation5. Även om de exakta farmakokinetiska egenskaperna varierar mellan SAA, är de relevanta grunderna som har testats experimentellt följande: (i) ett initialt flöde på 1,5-2 l / min balanserar alla kamrar (total volym ±550 ml) med önskad koncentration av anestesimedel inom 2 minuter; ii) koncentrationen av bedövningsånga som levereras till kamrarna inte förändras märkbart mellan den första och den sista platsen, eftersom mängden bedövningsmedel i gasvolymen i en enskild kammare (50 ml) vida överstiger den mängd som tas upp av ett antal flugor, och (iii) när kamrarna har balanserat kan bärgasflödet minskas (50-100 ml / min eller mindre) för att undvika avfall och förorening av miljön (flyktiga anestetika har växthusgasegenskaper). Det minimala flöde som krävs för att upprätthålla en steady-state-koncentration av ånga beror främst på läckaget av SAA, eftersom upptaget av ånga av flugorna är försumbar. Under dessa standardförhållanden (2% isofluran och 1,5 l/min bärgasflöde) bedövas flugor (dvs. immobiliseras) i alla positioner i matrisen inom 3-4 minuter, med omärkbara skillnader mellan positionerna. VGA kan administreras i minuter till timmar, och våra typiska exponeringsparadigmer ligger i intervallet 15 min till 2 h. För att spola systemet stängs förångaren av och flödet bibehålls för att utbyta cirka 10x volymer av matrisen (1,5 l / min i 5 minuter). Hastigheten för eliminering av anestesimedel varierar med den inställda flödeshastigheten.
Flyktiga bedövningsmedel interagerar med många fortfarande oidentifierade mål, inklusive det immuninflammatoriska systemet6. Bidraget från enskilda molekylära mål till primära kontra sidoresultat (“anestesitillstånd” kontra lång- och kortsiktiga “biverkningar”) är dåligt förstått. Därför är ett känsligt flugsystem med hög kapacitet värdefullt för att informera experiment på högre djur, trots de uppenbara skillnaderna mellan flugor och däggdjur7. Vissa skillnader kan faktiskt vara fördelaktiga; Till exempel skiljer sig flugans immunsystem från högre djur genom att det saknar den adaptiva armen i svaret8. Även om detta kan verka som en begränsning för att förstå sjukdom hos människor, erbjuder det en unik möjlighet att studera interaktionen mellan VGA och det medfödda immuninflammatoriska svaret isolerat från det adaptiva svaret9. Detta möjliggör studier av de farmakologiska effekterna av VGA på inflammation och deras modulering av de olika genetiska bakgrunderna som finns i en population.
Kritiska steg i konstruktionen av SAA inkluderar att säkerställa täta beslag för att undvika läckage av anestesiblandningen av gaser. SAA måste vara inrymd i en dragskåp för att undvika kontaminering av laboratorieutrymmet. Alla element från bärgasflaskorna till flödesindikatorn nedströms SAA bör kontrolleras enligt beskrivningen i checklistan.
Andra metoder för att administrera VGA till flugor är komplicerade att använda (inebriometern)21, har låg genomströmning 22, tillåter inte samtidig exponering av flera populationer 23, tillåter inte exakt kontroll av anestesikoncentrationen 21 eller har en avläsning som är svår att översätta till kliniskt accepterade termer 24.
Den nuvarande versionen av SAA bygger på en kommersiell vaporizer, och därför är toxikologiska studier begränsade till flyktiga anestetika. Om den används med andra flyktiga ämnen kan en förångare användas “off label” efter kalibrering av utgången. Alternativt kan en annan metod för förångning av de flyktiga ämnena tillämpas, vilket skulle kräva dedikerade mätningar för att titrera läkemedelskoncentrationerna, som beskrivits tidigare25.
Förutom flödesindikatorerna finns det inga larm (dvs. om tankarna är tomma kommer flödet genom SAA att avbrytas). Beroende på användningsintensiteten kan SAA behöva rengöras, dras åt och eventuellt bytas ut Tygon-slangen. Vi har utfört “underhåll” på vår ursprungliga SAA två gånger under 7 års användning.
Denna metod för att bedöva bananflugor möjliggör användning av den genetiska verktygslådan som finns tillgänglig för Drosophila-forskare i ett system med hög genomströmning. Flera kohorter av flugor från olika populationer (t.ex. genotyp, ålder, kön) kan samtidigt exponeras för identiska anestesikoncentrationer och den önskade kombinationen av bärargas (luft,O2,N2O, ädelgaser) som är lämplig för den aktuella forskningsfrågan.
Vi visar här att SAA har varit användbart för att avslöja oväntade förändringar i motståndskraft mot isoflurantoxicitet i ND2360114 fluglina och att vanliga laboratoriefluglinor skiljer sig åt i deras respons på AP. Att identifiera dessa fynd var möjligt på grund av den strikta kontrollen av experimentella förhållanden och SAA: s höga genomströmning.
SAA kan anpassas för att studera effekterna av andra flyktiga organiska föreningar (VOC) på insekter (t.ex. honungsbin). För VOC med ångtryck nära flyktiga anestetika (isofluran: 240 mmHg vid 20 °C) kan konventionella förångare användas, men utgången måste kalibreras. Den kommersiella vaporizern för desfluran värms upp, vilket potentiellt ger ytterligare flexibilitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Mark G. Perkins, Pearce Laboratory, Department of Anesthesiology, University of Wisconsin-Madison, för konstruktionen av SAA-prototypen. Arbetet stöds av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) med R01GM134107 och av FoU-fonden vid Institutionen för anestesiologi, University of Wisconsin-Madison.
Serial Anesthesia Array: | |||
5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
Zip Tie | >5inch | ||
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |