Denne metoden beskriver innkapsling av rabiesantigenet i biologisk nedbrytbare polymere mikropartikler med strukturelle og materielle egenskaper som muliggjør pulsatil frigjøring etter en forhåndsbestemt forsinkelse. Enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) vurdering av antigenet hentet fra partikkelkjernen bekrefter tilstedeværelsen av intakt trimerisk rabiesvirus glykoprotein gjennom partikkelfabrikasjon.
De nåværende retningslinjene for rabies posteksponeringsprofylakse krever flere injeksjoner administrert over flere uker. Dette kan være uforholdsmessig belastende for de som bor i lav- og mellominntektsland (LMICs), hvor flertallet av dødelige eksponeringer for rabies forekommer. Ulike legemiddelleveringsstrategier har blitt utforsket for å kondensere vaksineregimer til en enkelt injeksjon ved å innkapsle antigener i polymere partikler. Imidlertid kan sterke stressorer under innkapslingsprosessen forårsake denaturering av det innkapslede antigenet. Denne artikkelen beskriver en metode for innkapsling av rabiesvirusantigenet (RABV) i polymere mikropartikler som utviser justerbar pulsatil frigjøring. Denne metoden, kalt Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), genererer mikropartikler ved hjelp av myk litografi for å lage inverse polydimetylsiloksan (PDMS) former fra en multi-foton, 3D-trykt master mold. Poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA) filmer blir deretter kompresjonsstøpt inn i PDMS-formene for å generere åpne sylindere som er fylt med konsentrert RABV ved hjelp av en piezoelektrisk dispenseringsrobot. Disse mikrostrukturene blir deretter forseglet ved å varme opp toppen av partiklene, slik at materialet kan strømme og danne en kontinuerlig, ikke-porøs polymerbarriere. Etter fabrikasjon brukes en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) som er spesifikk for påvisning av intakt trimerisk rabiesvirusglykoprotein, for å bekrefte høy utvinning av immunogent antigen fra mikropartiklene.
Vaksinasjon er et ekstremt effektivt helseverktøy, etter å ha forhindret mer enn 37 millioner dødsfall mellom 2000 og 20191. Til tross for denne effektiviteten fortsetter vaksineforebyggende sykdommer å utgjøre en betydelig risiko for global helse, spesielt i lav- og mellominntektsland (LMICs) hvor høye forekomster av ikke- og undervaksinasjon bidrar til 1,5 millioner vaksineforebyggbare dødsfall årlig2. Rabies er ikke noe unntak fra disse forskjellene. Til tross for sin status som den mest dødelige sykdommen som er kjent for menneskeheten, er nesten universelt dødelig, er rabies fullt behandlingsbar og er klassifisert som utryddet i mange høyinntektsland. I stedet bæres byrden av rabies uforholdsmessig av mennesker som bor i deler av Asia og Afrika, hvor sykdommen har ødeleggende utfall på mennesker og husdyr 3,4.
Vaksinasjon er avgjørende for å håndtere den globale effekten av rabies5. Kostnaden for vaksinasjon forbyr utbredt implementering av preeksponeringsprofylakse (PrEP), med tanke på den generelle lave forekomsten av sykdommen. Videre er nytten av posteksponeringsprofylakse (PEP) i LMICs begrenset av sosioøkonomisk press på pasienter som søker helsetjenester. Logistiske faktorer, som reiseavstand til tilgangspunkter for helsetjenester, tapt lønn under behandling, behandlingskostnader, avtaler som forstyrrer daglige aktiviteter og glemsomhet, resulterer i PEP-etterlevelsesrater så lave som 60 %6,7. Denne høye pasientslitasjen gir en mulighet for raffinering av tilnærminger for å løse hull i rabiesvaccinering for å bekjempe sykdommen.
Enkeltinjeksjon (SI) vaksinasjonssystemer som kontrollerer frigjøring av antigener har blitt utforsket som måter å oppnå full immunisering i en injeksjon. Eliminering av behovet for flere besøk til helsepersonell reduserer byrdene som hindrer enkeltpersoner i å søke tilstrekkelig omsorg. For å oppnå SI-vaksinasjon er et antigen vanligvis innkapslet i en biologisk nedbrytbar polymer matriks som ofte tar form av injiserbare mikropartikler. Når den er injisert, nedbryter polymeren og frigjør det sekvestrerte antigenet. Hittil har to primære frigjøringsstrategier blitt fulgt for å oppnå SI-vaksinasjon. I en tilnærming frigjøres antigenet kontinuerlig over en lengre periode. Selv om det er ment å øke immunogeniteten til en enkelt injeksjon, er det uklart om denne tilnærmingen er tilstrekkelig til å fremkalle en beskyttende immunrespons mot rabiesvirus (RABV) hos mennesker8. I den andre frigjøres antigenet etter en forhåndsbestemt forsinkelse for å etterligne et konvensjonelt og bevist prime-boost-vaksineregime. Spraytørking og emulsjon / løsningsmiddelfordampningsbaserte mikropartikkelfabrikasjonsmetoder viser den tidligere strategien, og har blitt brukt til å innkapsle både modellvaksiner9 og svært stabile antigener, som tetanustoksoid10. Imidlertid involverer disse innkapslingsmetodene stressorer, inkludert varme, løsningsmiddelinteraksjon og fysiske krefter, som kan denaturere antigener11.
Partikler Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) er en nylig utviklet fabrikasjonsmetode som kan brukes til å kapsle inn biologiske legemidler i biologisk nedbrytbare mikropartikler. Mikromolding brukes til å generere partikler som er fylt med flytende nyttelast og oppvarmet for å tillate polymeren å flyte og fullstendig innkapsle det sentrale lastdepotet i et sammenhengende lag av den biologisk nedbrytbare polymeren. Denne mikrostrukturen resulterer i pulsatil frigjøring av nyttelasten, etter en varighet som er avhengig av nedbrytningshastigheten til det polymere skallet12. Dette manuskriptet demonstrerer innkapslingen av inaktivert RABV i mikropartikler sammensatt av poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA), en biologisk nedbrytbar polymer brukt i mange FDA-godkjente formuleringer13, ved bruk av PULSED-fabrikasjonsmetoden for å innkapsle stabilt RABV-antigen som evaluert av en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Ved å kombinere PLGA-partikler med forskjellig molekylvekt og / eller sluttgrupper, har denne tilnærmingen potensial til å etterligne det nåværende rabiesvaksinasjonstidsforløpet etter en enkelt injeksjon.
Det er mulig å endre partikkelgeometri for spesifikke behov; For sylindriske strukturer anbefaler forfatterne imidlertid å opprettholde et forhold på 5: 4: 1 av høyde: diameter: veggtykkelse beskrevet i protokollen. Dette sideforholdet sikrer at nok PLGA-materiale er til stede for å forsegle partiklene og forbli mekanisk robuste nok til håndtering. Partikkeldimensjoner og former kan enkelt endres under CAD-prosessen, slik at en myriade av geometrier kan genereres. Ved å kombinere fleksibiliteten til CAD med 3D-utskrift kan du raskt iterere mikropartikkeldesign. Selv om denne protokollen bruker en multi-foton 3D-skriver, kan enhver 3D-skriver med spesifikasjoner som kan skrive ut mikrostrukturdimensjonene i et passende materiale, brukes til å generere den første hovedformen. Videre har fotolitografi tidligere blitt brukt til å lage lignende strukturer i arrays mye større enn de som produseres i denne protokollen; Arbeidet, forsinkelsen med å bestille skreddersydde fotomasker og tilgjengeligheten av utstyr ville imidlertid bremse den iterative designprosessen16. Endelig kan masterformgenerering outsources til gebyr-for-service-selskaper hvis intern hovedformfabrikasjon ikke er mulig. Uansett hvilken 3D-skriver eller metode som brukes til å generere masterformene, er vedheft av utskriften til underlaget avgjørende for nedstrømstrinn. Spesielt, hvis vedheft er utilstrekkelig under PDMS-formgenerering, vil trykte partikler forbli fast i PDMS-formen, noe som krever manuell fjerning av de trykte partiklene og ødeleggelse av hovedformen.
Partikkelfylling er et annet kritisk aspekt å vurdere. Mikropartikler har begrenset fyllingskapasitet, så filtrering brukes ikke bare til å konsentrere RABV-antigenet, men også for å fjerne stamhjelpestoffer som ellers ville oppta en stor del av mikropartikkelkjernevolumet. Gitt den store størrelsen på RABV-antigenet (ca. 60 nm x 180 nm)17, er det imidlertid mulig å delvis pelletere ut antigenet under sentrifugeringstrinnene. Av denne grunn er det viktig å resuspendere antigenet ved pipettering eller vortexing etter sentrifugering for å oppnå høy utvinning av RABV-antigenet. En høykonsentrert løsning er ideell for dispensering, fordi den reduserer dispenseringssyklusene og dermed begrenser antigennedbrytningen under fylling. Viskositet er imidlertid en stor begrensning for piezoelektriske dispenseringsroboter som danner et stabilt fall, så det er kanskje ikke mulig eller tilrådelig å dispensere en løsning med svært høy konsentrasjon. Fortynning av fylleløsningen er den enkleste måten å oppnå en stabil dråpedannelse på, men antigenstabilitet over de ekstra fyllingssyklusene som trengs for å oppnå ønsket belastning og lengre tid som kreves for å fylle partikler, bør vurderes.
Begrensninger
Denne metoden krever høyt spesialisert utstyr for å produsere de første formene og et spesialisert fyllinstrument for mikropartikkelproduksjon. Selv om behovet for en 3D-skriver med en utskriftsoppløsning som er i stand til å generere de første masterformene, kan undergraves av en avgiftsbelagt tilnærming, er tilgjengeligheten til en piezoelektrisk dispenserrobot begrensende. Anskaffelse av en piezoelektrisk dispenserrobot krever en betydelig innledende forhåndsinvestering, ofte i størrelsesorden $ 80,000 til $ 200,000, avhengig av merke, gjennomstrømning og evner. Selv om flere andre fyllingsmetoder er potensielle alternativer, har disse metodene ikke blitt validert ved bruk av RABV-antigen12.
Fremtidige applikasjoner
En betydelig andel innkapslet RABV-antigen forble stabilt gjennom forseglingsprosessen. I teorien, ved å inkorporere dette antigenet i partikler sammensatt av forskjellige typer PLGA som etterligner administrasjonstidslinjen for posteksponeringsprofylaksebehandling, kan alle doser administreres i en enkelt injeksjon. Eliminering av behovet for gjentatte sykehusbesøk for å administrere ytterligere doser vil forbedre pasientens etterlevelse, noe som resulterer i bedre behandlingsresultater. Videre, etter å ha demonstrert evnen til å beholde ELISA-reaktiviteten til det svært komplekse inaktiverte rabiesviruset, er det sannsynlig at andre antigener, inkludert subenhetsvaksiner, ville være kompatible med denne innkapslingsmetoden. Bruk av andre profylaktiske antigener med pulserende mikropartikler kan redde millioner av liv i LMICs ved å øke vaksinasjonsgraden for undervaksinerte befolkninger. For å oppnå dette må vaksiner imidlertid forbli stabile gjennom ikke bare innkapsling, men også frigjøring, noe som kan være utfordrende siden nyttelasten vil bli utsatt for forhøyede temperaturer og et potensielt surt mikromiljø på grunn av kroppsvarme og PLGA-nedbrytningsprodukter18. Fremtidig arbeid vil forfølge stabiliserende strategier for antigenet gjennom frigjøring, noe som vil åpne potensialet for en enkeltinjeksjonsvaksinasjonsplattform som er bredt anvendelig for å forhindre mange smittsomme sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Chiron Behring og Bharat Biotech International for å gi partikler for menneskeheten med RABV-antigenet. Vi vil også gjerne anerkjenne Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., for hans uvurderlige veiledning og tekniske bidrag. Forfatterne vil gjerne takke generøsiteten til Dr. Rebecca Richards-Kortum for å tillate bruk av hennes SciFLEXARRAYER S3 picoliter dispenseringsapparat og Dr. Chelsey Smiths instruksjon om bruk av enheten. Vi anerkjenner også University of Massachusetts Chan Medical School for å generere mikroskopibilder av rabiesantigenet. Til slutt takker vi Don Chickering og Erin Euliano for å gjennomgå dokumentet før innsending. Dette arbeidet ble støttet av et stipend (INV-004360) fra Bill og Melinda Gates Foundation.
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |