Her demonstrerer vi bruken av cellebasert elektrisk impedans (CEI) som en veldig enkel og grei metode for å studere Zika-virusinfeksjon og replikasjon i humane celler i sanntid. Videre er CEI-analysen nyttig for evaluering av antivirale forbindelser.
Cellebasert elektrisk impedans (CEI) -teknologi måler endringer i impedans forårsaket av et voksende eller manipulert adherent cellemonolag på kulturplatebrønner innebygd med elektroder. Teknologien kan brukes til å overvåke konsekvensene av zikavirus (ZIKV) infeksjon og adherent cellereplikasjon i sanntid, da dette viruset er svært cytopatogent. Det er en enkel analyse som ikke krever bruk av etiketter eller invasive metoder, og har fordelen av å gi sanntidsdata. Kinetikken til ZIKV-infeksjon er svært avhengig av den anvendte cellelinjen, virusstammen og mangfoldet av infeksjoner (MOI), som ikke lett kan studeres med konvensjonelle endepunktanalyser. Videre kan CEI-analysen også brukes til evaluering og karakterisering av antivirale forbindelser, som også kan ha dynamiske hemmende egenskaper i løpet av infeksjonen. Denne metodeartikkelen gir en detaljert forklaring av den praktiske utførelsen av CEI-analysen og dens potensielle anvendelser i ZIKV-forskning og antiviral forskning generelt.
Zikavirus (ZIKV) utbrudd er forbundet med alvorlige sykdomskomplikasjoner, som mikrocefali og Guillain-Barré syndrom 1,2,3. Selv om fremtidige epidemier er plausible på grunn av ulike risikofaktorer som spredning av myggvektordistribusjon og økende urbanisering, har hittil ingen vaksine eller antiviralt legemiddel kommet på markedet ennå 3,4. Derfor bør tradisjonelle ZIKV-forskningsmetoder suppleres med nye verktøy for å studere dette viruset og dets potensielle antivirale forbindelser. Antiviral forskning er ofte basert på fenotypiske analyser, hvor endepunktet er tilstedeværelsen av en spesifikk parameter, for eksempel utseendet til en virusindusert cytopatisk effekt (CPE) eller produksjon av et bestemt virusindusert protein ved hjelp av et reportergen 5,6,7. Disse metodene har imidlertid endepunktavlesninger, er arbeidskrevende og kan kreve komplisert analyse. Derfor er impedansbaserte metoder et attraktivt alternativ.
Cellebasert elektrisk impedans (CEI) er definert som motstanden mot strømstrøm fra en elektrode til en annen, forårsaket av et adherent cellelag sådd på elektrodeholdige brønner. Den etablerte CEI-teknologien som brukes i denne metodikken er Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), opprinnelig utviklet av Giaever og Keese 8,9. Dette brukes i et bredt felt av biologiske forskningsdomener, som kreftmetastase, toksikologi og sårheling10,11,12. Prinsippet er avhengig av et elektrisk felt som genereres ved kontinuerlig feiing av vekselstrøm (AC) spenninger over en rekke frekvenser13. Cellene eksponeres for disse ikke-invasive elektriske feltene, og med forhåndsbestemte intervaller måles impedansendringene forårsaket av cellevekst eller endringer i celleadherens eller morfologi14. Videre fører endret cellelevedyktighet også til impedansendringer, noe som gjør teknologien til et nyttig verktøy for å overvåke infeksjon med cytopatogene virus15,16,17. Siden morfologiske endringer i cellelaget vil bli oppdaget på nanoskalaområdet, tilbyr teknologien et svært følsomt deteksjonsverktøy. CEI-analysen beskrevet i denne artikkelen er en enkel, ikke-invasiv, sanntids, etikettfri metode for å måle impedansendringene i cellelaget over tid.
Selv om CEI ikke har blitt brukt til å evaluere løpet av ZIKV-infeksjon eller dets potensielle antivirale midler, har bruken som et diagnostisk verktøy blitt undersøkt før18. I en nylig studie ble bruken av CEI-analysen for å bestemme den antivirale aktiviteten til flere ZIKV-hemmere i A549-celler validert for første gang19. Denne metodeartikkelen beskriver denne CEI-analysen mer detaljert og utvider den til forskjellige adherente cellelinjer, samt en rekke ZIKV-stammer ved forskjellige infeksjonsmultiplikasjoner (MOI). Herved demonstreres allsidig bruk av denne metoden i flavivirus antiviral forskning. Metoden har den avgjørende fordelen med sanntids celleovervåking, som gjør det mulig å oppdage viktige infeksjonstidspunkter og den dynamiske hemmende aktiviteten av potensielle antivirale forbindelser. Samlet sett tilbyr CEI-teknologien et kraftig og verdifullt verktøy for å utfylle dagens spekter av antivirale metoder.
Denne artikkelen beskriver bruken av CEI-analysen i ZIKV antiviral forskning. Analysen har fordelen av sanntidsovervåking og kan derfor brukes til å evaluere kinetikken til ZIKV-infeksjon og antiviral inhibering med selektive forbindelser. Dataene oppnådd med denne metoden tillater en objektiv og visuell observasjon av virusindusert CPE og styrken av en potensiell antiviral forbindelse.
Siden CEI er en svært følsom metode, må det utvises stor forsiktighet når du utfører denne cellulære analysen. Det er avgjørende at nøyaktig pipettering utføres for å unngå pipetteringsvariasjon så mye som mulig. Videre må andre faktorer som kan påvirke eksperimentelle resultater, for eksempel cellenummer og brukt viruslager, holdes konstant mellom eksperimentrepetisjoner. Dette er faktorer som i stor grad påvirker kinetikken til cellevekst og infeksjon og kan derfor føre til variasjon i beregnede CIT50-verdier og/eller andre parametere.
Når du utfører CEI-analysen i nærvær av (potensielle) antivirale forbindelser, er det viktig å avgjøre om de påvirker impedansen til cellene i fravær av et virus. Teknikken er så følsom at impedansendringer kan måles godt under forbindelsens cytotoksiske konsentrasjoner19.
Selv om bare ZIKV-data er vist i denne artikkelen, kan analysen enkelt brukes på andre cytopatogene (flavi) virus, med bare minimal optimaliseringsinnsats, for eksempel optimal CEI-overvåkingsfrekvensbestemmelse. Tilpasninger av CEI-analysen har blitt brukt med forskjellige humane og dyrevirus, som chikungunya, influensa A og humane og hesteherpesvirus25,26,27,28. Her brukes den også som en enkel metode for kvantifisering av virale titere eller for identifisering av antivirale forbindelser. Disse studiene brukte sanntids celleanalyse, en alternativ CEI-metode.
Bruken av CEI-teknologien er begrenset til adherente celletyper, da analysens prinsipp er avhengig av egenskapene til adherente celler for å spre seg over de elektrodeinnebygde brønnene. Godt overflatebelegg som fibronektin kan brukes til å forbedre cellevedlegg29. Metoden har noen andre ulemper, den første relatert til kostnadene. Bortsett fra investeringen i CEI-overvåkingsenheten og tilhørende hard- og programvare, er forbruksvarene også noe dyre. Videre, siden protokollen krever overvåking av virusinfeksjon i flere dager, kan en 96-brønnplate per uke evalueres. Sammen med de høye kostnadene begrenser dette bruken til innstillinger med lav til middels gjennomstrømming.
På grunn av disse gjennomstrømningsproblemene er teknologien uegnet for antivirale screeninginnstillinger. Det er imidlertid svært tiltalende i innledende eksperimentelle faser, for eksempel når man vurderer cellefølsomhet for studiet av ZIKV-infeksjon i en bestemt sykdomsrelatert setting. Teknologien er også nyttig med transfekterte eller knockout-cellelinjer for enkelt å observere endringer i infeksjonskinetikk, for eksempel i nærvær eller fravær av visse inngangsreseptorer. Dette er interessant når man undersøker involvering av cellulære faktorer i ZIKV-infeksjon. Videre, i senere prekliniske faser, når en bestemt lederkandidat er valgt, kan CEI-analysen brukes til ytterligere grundig karakterisering av en valgt forbindelse. CEI-biosensorer kan også modifiseres ved å immobilisere visse biogjenkjenningselementer, for eksempel virusspesifikke antistoffer, for påvisning av virus18. Til sammen fremhever dette den allsidige bruken av CEI i en virologiinnstilling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Clément Heymann og Gorrit Lootsma for korrekturlesing av manuskriptet. Studien ble støttet av interne tilskudd fra laboratoriet for virologi og kjemoterapi (Rega Institute, KU Leuven).
A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |