Evaluering av immunresponsen til en nanoemulsjonsadjuvant vaksine mot meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) infeksjon
Summary
Den foreliggende protokollen forbereder og evaluerer de fysiske egenskapene, immunresponsen og in vivo beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine.
Abstract
Nanoemulsjon adjuvante vaksiner har tiltrukket seg omfattende oppmerksomhet på grunn av sin lille partikkelstørrelse, høy termisk stabilitet og evne til å indusere valide immunresponser. Imidlertid er det viktig å etablere en rekke omfattende protokoller for å evaluere immunresponsen til en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine. Derfor inneholder denne artikkelen en streng prosedyre for å bestemme de fysisk-kjemiske egenskapene til en vaksine (ved transmisjonselektronmikroskopi [TEM], atomkraftmikroskopi [AFM] og dynamisk lysspredning [DLS]), stabiliteten til vaksineantigenet og systemet (ved en høyhastighets sentrifugetest, en termodynamisk stabilitetstest, SDS-PAGE og western blot) og den spesifikke immunresponsen (IgG1, IgG2a og IgG2b). Ved hjelp av denne tilnærmingen kan forskere nøyaktig evaluere den beskyttende effekten av en ny nanoemulsjonsadjuvant vaksine i en dødelig MRSA252 musemodell. Med disse protokollene kan den mest lovende nanoemulsjonsvaksineadjuvansen med hensyn til effektivt adjuvanspotensial identifiseres. I tillegg kan metodene bidra til å optimalisere nye vaksiner for fremtidig utvikling.
Introduction
Meticillinresistente gule stafylokokker (MRSA) er et opportunistisk patogen med en av de høyeste infeksjonsratene i en intensivavdeling (ICU) avdeling1, kardiologiske avdelinger og brannavdelinger over hele verden. MRSA viser høy forekomst av infeksjon, dødelighet og bred legemiddelresistens, noe som gir store vanskeligheter i klinisk behandling2. I den globale prioriteringslisten over antibiotikaresistente bakterier utgitt av Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2017, ble MRSA oppført i den mest kritiske kategorien3. Det haster derfor med en vaksine mot MRSA-infeksjon.
Aluminiumadjuvans har vært brukt i lang tid, og den adjuvante hjelpemekanismen er relativt klar, sikker, effektiv og godt tolerert4. Aluminiumadjuvanser er for tiden en mye brukt type adjuvans. Det er generelt antatt at antigener adsorbert på aluminiumsaltpartikler kan forbedre stabiliteten og forbedre injeksjonsstedets evne til å ta opp antigener, noe som gir god absorpsjon og langsom frigjøring5. For tiden er den største ulempen med aluminiumadjuvanser at de mangler en adjuvans effekt eller bare utviser en svak adjuvant effekt på noen vaksinekandidatantigener6. I tillegg induserer aluminiumadjuvanser IgE-medierte hypersensitivitetsreaksjoner5. Derfor er det nødvendig å utvikle nye hjelpestoffer for å stimulere en sterkere immunrespons.
Nanoemulsjonsadjuvanser er kolloidale dispersjonssystemer sammensatt av olje, vann, overflateaktive midler og kosurfaktanter7. I tillegg er hjelpestoffene termodynamisk stabile og isotrope, kan autoklaveres eller stabiliseres ved høyhastighets sentrifugering, og kan dannes spontant under milde prepareringsforhold. Flere emulsjonsadjuvanser (som MF59, NB001-002-serien, AS01-04-serien, etc.) er for tiden på markedet eller i klinisk forskningsstadium, men deres partikkelstørrelser er større enn 160 nm8. Derfor kan fordelene ved medisinske preparater på nanoskala (1-100 nm) (dvs. stort spesifikt overflateareal, liten partikkelstørrelse, overflateeffekt, høy overflateenergi, liten størrelseseffekt og makrokvantetunneleffekt) ikke utnyttes fullt ut. I denne protokollen har en ny adjuvans basert på nanoemulsjonsteknologi med en diameterstørrelse på 1-100 nm blitt rapportert å vise god adjuvans aktivitet9. Vi testet rekombinasjon subenhet vaksine antigen protein HI (α-hemolysin mutant [Hla] og Fe ion overflatebestemmende faktor B [IsdB] subenhet N2 aktivt fragment fusjonsprotein); En rekke prosedyrer ble etablert for å undersøke de fysiske egenskapene og stabiliteten, evaluere den spesifikke antistoffresponsen etter intramuskulær administrering, og teste den beskyttende effekten av vaksinen ved hjelp av en systemisk infeksjonsmodell fra mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, et bakteriecelleveggforankret og jernregulert overflateprotein, spiller en viktig rolle i prosessen med å skaffe hemejern15. Hla, alfatoksin, er blant de mest effektive bakterietoksinene som er kjent i MRSA, og kan danne porer i eukaryote celler og forstyrre adhesjon og epitelceller16. I vår studie ble et nytt rekombinasjon MRSA-antigenprotein (HI) konstruert og uttrykt med genteknologisk teknologi basert på antigengenene til IsdB og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, nr. 32070924 og 32000651 av NSFC, og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
