Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik

Summary

Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.

Abstract

Durch Transplantate übertragbare, phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten wie Viren, Viroide und Bakterien sind weltweit für verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verantwortlich. Zum Beispiel hat das Citrus-Tristeza-Virus weltweit über 100 Millionen Zitrusbäume getötet, während “Candidatus Liberibacter asiaticus” Florida 9 Milliarden Dollar gekostet hat. Die Verwendung von pathogengetestetem Zitrusknospenholz für die Baumvermehrung ist der Schlüssel zur Bekämpfung solcher Krankheitserreger. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, verwendet Polymerase-Kettenreaktions-Assays (PCR), um jedes Jahr Tausende von Proben von Zitrusblütenbäumen zu testen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und dem National Clean Plant Network saubere Vermehrungseinheiten zur Verfügung zu stellen. Ein schwerwiegender Engpass beim molekularen Hochdurchsatznachweis von Zitrusviren und Viroiden ist der Verarbeitungsschritt des Pflanzengewebes.

Die richtige Gewebepräparation ist entscheidend für die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und die nachgelagerte Verwendung in PCR-Assays. Das Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren von Pflanzengewebe bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden, ist zeit- und arbeitsintensiv und erfordert teure und spezialisierte Laborgeräte. In diesem Artikel wird die Validierung eines speziellen Instruments vorgestellt, das entwickelt wurde, um phloemreiches Rindengewebe aus Zitrusknospenholz schnell zu verarbeiten, das als Knospengewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Das HdO erhöht den Probendurchsatz um 100 % im Vergleich zu aktuellen Methoden. Darüber hinaus senkt es den Arbeitsaufwand und die Kosten für die Ausrüstung. In dieser Arbeit wiesen die HdO-Proben eine DNA-Ausbeute (80,25 ng/μL) auf, die mit dem Handhackprotokoll des CCPP (77,84 ng/μL) vergleichbar war. Dieses Instrument und das Protokoll zur schnellen Verarbeitung von Pflanzengewebe können mehreren diagnostischen Zitruslaboren und -programmen in Kalifornien zugute kommen und zu einem Modellsystem für die Gewebeverarbeitung für andere holzige mehrjährige Kulturen weltweit werden.

Introduction

Durch Transplantate übertragbare phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten, wie Viroide, Viren und Bakterien, haben in allen Zitrusanbaugebieten der Welt verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verursacht. Zitrusviroide sind limitierende Produktionsfaktoren aufgrund der Exokortis- und Kachexie-Krankheiten, die sie bei wirtschaftlich wichtigen Zitrusarten wie Dreiblatt, Dreiblatthybriden, Mandarinen, Clementinen und Mandarinen verursachen ^1,2,3. In Kalifornien sind diese viroidempfindlichen Zitrussorten die Grundlage für den wachsenden und profitablen Markt der “Easy-Peeler” und folgen damit dem sich wandelnden Trend in der Präferenz der Verbraucher für Früchte, die leicht zu schälen, segmentiert und kernlos sind ^4,5,6. So werden Zitrusviroide im Rahmen des California Department of Food and Agriculture (CDFA) “Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140” reguliert, und die Labore der Plant Pest Diagnostics Branch der CDFA führen jährlich Tausende von Zitrusviroidtests durch 7,8,9,10 . Das Citrus-Tristeza-Virus (CTV) ist seit Beginn der globalen Epidemie in den 1930er Jahren für das Absterben von über 100 Millionen Zitrusbäumen verantwortlich 3,9,10,11. In Kalifornien stellen Lochfraß und Isolate des Virus, die Trifoliate brechen, eine ernsthafte Bedrohung für die 3,6 Milliarden Dollar schwere kalifornische Zitrusindustrie dar^12,13,14. Folglich stuft die CDFA CTV als regulierten Pflanzenschädling der Klasse A ein, und das Labor der Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) führt jedes Jahr umfangreiche Felduntersuchungen und Tausende von Virustests durch^15,16. Es wird geschätzt, dass das Bakterium “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) und die Huanglongbing-Krankheit (HLB) in Florida einen wirtschaftlichen Schaden von fast 9 Milliarden US-Dollar verursacht haben, was auf eine Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 40 %, einen Rückgang der Zitrusproduktion um 57 % und einen Verlust von fast 8.000 Arbeitsplätzen zurückzuführen^{ist 17,18}. In Kalifornien wurde prognostiziert, dass eine hypothetische Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 20 % aufgrund von HLB zu mehr als 8.200 Arbeitsplatzverlusten und einer Verringerung des Bruttoinlandsprodukts des Staates um über eine halbe Milliarde Dollar führen würde. Daher gibt das Citrus Pest and Disease Prevention Program jährlich über 40 Millionen US-Dollar für Erhebungen aus, um CLas aus Kalifornien zu testen, zu erkennen und auszurotten^14,17,19,20.

Ein Schlüsselelement bei der Bekämpfung von Zitrusviroiden, Viren und Bakterien ist die Verwendung von pathogengetestetem Vermehrungsmaterial (z. B. Knospenholz) für die Baumproduktion. Auf Krankheitserreger getestetes Zitrusblütenholz wird im Rahmen umfassender Quarantäneprogramme produziert und gepflegt, die fortschrittliche Techniken zur Eliminierung und zum Nachweis von Krankheitserregern einsetzen^10,21. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, testet jedes Jahr Tausende von Knospenholzproben von Zitrussorten, die neu in den Bundesstaat und die USA importiert wurden, sowie von Zitrusblütenbäumen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und die Funktionen des National Clean Plant Network for Citrus^{zu unterstützen 10,17,22}. Um das große Volumen an Zitrustests bewältigen zu können, sind zuverlässige und kostengünstige Assays zum Nachweis von Krankheitserregern mit hohem Durchsatz eine grundlegende Komponente für den Erfolg von Programmen wie dem CCPP ^7,10,22.

Während molekularbasierte Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine deutliche Steigerung des Durchsatzes in pflanzendiagnostischen Laboren ermöglicht haben, ist unserer Erfahrung nach einer der kritischsten Engpässe bei der Implementierung von Hochdurchsatzprotokollen der Verarbeitungsschritt der Probe von Pflanzengewebe. Dies gilt insbesondere für Zitrusfrüchte, da die derzeit verfügbaren Protokolle für die Verarbeitung von phloemreichen Geweben wie Blattstielen und Knospenholzrinde arbeitsintensiv und zeitaufwändig sind und teure und spezialisierte Laborgeräte erfordern. Diese Protokolle erfordern manuelles Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden 8,23,24. Im CCPP-Diagnoselabor umfasst die Probenverarbeitung beispielsweise (i) Häckseln von Hand (6-9 Proben/h/Bediener), (ii) Gefriertrocknung (16-24 h), (iii) Pulverisierung (30-60 s) und (iv) Zentrifugation (1-2 h). Der Prozess erfordert auch spezielle Verbrauchsmaterialien (z. B. hochbelastbare Safe-Lock-Röhrchen, Edelstahl-Mahlkugeln, Adapter, Klingen, Handschuhe) und mehrere kostspielige Laborgeräte (z. B. Ultratiefkühlschrank, Gefriertrockner, Gewebepulverisierer, Kryostation mit flüssigem Stickstoff, gekühlte Zentrifuge).

Wie in jeder Branche sind der Anlagenbau und die Automatisierung von Prozessen der Schlüssel, um Kosten zu senken, den Durchsatz zu erhöhen und qualitativ hochwertige, einheitliche Produkte und Dienstleistungen bereitzustellen. Die Zitrusindustrie benötigt kostengünstige Tissue-Verarbeitungsinstrumente, die nur minimale Fähigkeiten erfordern und daher leicht in diagnostische Labore und Feldbetriebe übertragen werden können, um eine hohe Probenverarbeitungskapazität für einen schnellen nachgeschalteten Nachweis von Krankheitserregern zu ermöglichen. Technology Evolving Solutions (TES) und das CCPP entwickelten (d. h. entwerfen und herstellen) und validierten (d. h. getestet mit Zitrusproben und verglichen mit Standard-Laborverfahren) ein kostengünstiges Instrument für die schnelle Verarbeitung von phloemreichem Zitrusgewebe (d. h. Knospenholz) und validierten (d. h. es wurde mit Zitrusproben getestet und mit Standard-Laborverfahren verglichen), das als Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, enthält das HdO eine Basiskomponente für die Stromversorgung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Mahlscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe aus dem Zitrusknospenholz zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze mit Extraktionspuffer ausgestoßen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet (Abbildung 1). Das HdO-System umfasst auch eine papierlose Probenverfolgungsanwendung und eine integrierte Wägeanwendung, die die Informationen zur Probenverarbeitung in Echtzeit in einer Online-Datenbank aufzeichnen.

Das HdO-System hat die labordiagnostische Kapazität des CCPP um über 100 % gesteigert und hat durchgängig Zitrusgewebeextrakte produziert, die für die Aufreinigung hochwertiger Nukleinsäuren und den nachgeschalteten Nachweis von durch Transplantate übertragbaren Krankheitserregern von Zitrusfrüchten mittels PCR-Assays geeignet sind. Genauer gesagt hat HdO die Zeit für die Gewebeverarbeitung von über 24 Stunden auf ~3 Minuten pro Probe reduziert, Laborinstrumente ersetzt, die über 60.000 US-Dollar gekostet haben (Abbildung 2, Schritte 2-4) und die Verarbeitung größerer Probengrößen ermöglicht.

In diesem Artikel werden die Validierungsdaten für die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern mit Zitrusblütenholzproben von Quellbäumen vorgestellt, einschließlich aller geeigneten Positiv- und Negativkontrollen aus der CCPP Rubidoux Quarantine Facility bzw. der Lindcove Foundation Facility. Außerdem stellen wir die Durchsatz- und Bearbeitungszeitveränderungen im Vergleich zum aktuellen Laborverfahren dar (Abbildung 2). Darüber hinaus bietet diese Arbeit ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für Testlabore für Zitruspathogene und zeigt, wie das HdO-System die Funktionen von Krankheitserreger-sauberen Baumschulbeständen, Erhebungs- und Eradikationsprogrammen unterstützen kann.

Abbildung 1: Knospenholz-Gewebeextraktor. Das HdO enthält eine Basiskomponente für Leistung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Schleifscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe von Zitrusknospen zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze ausgeworfen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet. Abkürzung: HdO = Knospenholz-Gewebeextraktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Vergleich zwischen dem konventionellen Handhackverfahren im Labor und der HdO-Verarbeitung. Die HdO-Verarbeitung umfasst die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe mit hohem Durchsatz, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern. Die Zeit für jeden Schritt wird in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Sammeln der Zitrusknospenholzproben für den Versand Senden Sie Technology Evolving Solutions eine Tabelle mit Bauminformationen, die sie in ihren Webserver laden können (schließlich wird der Benutzer neue Bäume erstellen). Verwenden Sie den TES-Tracker der Telefon-App, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie ein NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden. Legen Sie drei bis vier Zitruskn…

Representative Results

RNA-Extraktion, -Aufreinigung und -Qualität unter Verwendung von HdO-verarbeitetem Knospenholz-Zitrusgewebe und Bewertung der Zeit für die GewebeverarbeitungFür diesen Test haben wir Knospenholzproben von 255 repräsentativen Zitrusbäumen verwendet, um die RNA-Qualität des HdO mit dem Standardverfahren zu vergleichen. Die Proben wurden mit dem Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) verarbeitet (Protokollschritte 4.1-4.6 und Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) oder nach der …

Discussion

Mit dem Aufkommen der HLB-Zitruskrankheit wurden die Zitrusindustrie, die Zulassungsbehörden und die Diagnoselabore aufgefordert, sich auf Nukleinsäureextraktionsmethoden mit hohem Durchsatz in Kombination mit manueller Probenverarbeitung mit niedrigem Durchsatz und Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie qPCR³⁴ für die Untersuchung einzelner Bäume in Kombination mit Krankheitsmanagementpraktiken^{zu verlassen 35}. Die HLB-Positivitätsrate in Kalifornien ist von 0,…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line