Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

Summary

Abbiamo progettato, fabbricato e convalidato uno strumento che elabora rapidamente i tessuti di corteccia di agrumi ricchi di floema. Rispetto ai metodi attuali, l’estrattore di tessuti di gemme (BTE) ha aumentato la produttività dei campioni e diminuito i costi di manodopera e attrezzature necessari.

Abstract

Gli agenti patogeni degli agrumi trasmissibili e limitati al floema degli agrumi, come virus, viroidi e batteri, sono responsabili di epidemie devastanti e gravi perdite economiche in tutto il mondo. Ad esempio, il virus della tristeza degli agrumi ha ucciso oltre 100 milioni di alberi di agrumi in tutto il mondo, mentre il “Candidatus Liberibacter asiaticus” è costato alla Florida 9 miliardi di dollari. L’uso di gemme di agrumi testate per i patogeni per la propagazione degli alberi è fondamentale per la gestione di tali patogeni. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l’Università della California, Riverside, utilizza saggi di reazione a catena della polimerasi (PCR) per testare ogni anno migliaia di campioni di alberi di origine di gemme di agrumi per proteggere gli agrumi della California e per fornire unità di propagazione pulite al National Clean Plant Network. Un grave collo di bottiglia nella rilevazione molecolare ad alto rendimento di virus e viroidi degli agrumi è la fase di elaborazione dei tessuti vegetali.

Una corretta preparazione dei tessuti è fondamentale per l’estrazione di acidi nucleici di qualità e per l’uso a valle nei saggi PCR. La triturazione, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature dei tessuti vegetali per evitare la degradazione degli acidi nucleici richiedono molto tempo e manodopera e richiedono attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questo documento presenta la convalida di uno strumento specializzato progettato per elaborare rapidamente tessuti di corteccia ricchi di floema da gemme di agrumi, chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Il BTE aumenta la produttività del campione del 100% rispetto ai metodi attuali. Inoltre, riduce la manodopera e il costo delle apparecchiature. In questo lavoro, i campioni di BTE avevano una resa del DNA (80,25 ng/μL) paragonabile al protocollo di taglio manuale del CCPP (77,84 ng/μL). Questo strumento e il protocollo di elaborazione rapida dei tessuti vegetali possono avvantaggiare diversi laboratori e programmi diagnostici sugli agrumi in California e diventare un sistema modello per il trattamento dei tessuti per altre colture perenni legnose in tutto il mondo.

Introduction

Gli agenti patogeni trasmissibili degli agrumi a basso floema, come viroidi, virus e batteri, hanno causato epidemie devastanti e gravi perdite economiche in ogni area produttrice di agrumi del mondo. I viroidi degli agrumi sono fattori di produzione limitanti a causa delle malattie da esocortis e cachessia che causano in tipi di agrumi economicamente importanti, come trifogliati, ibridi trifogliati, mandarini, clementine e mandarini ^1,2,3. In California, questi tipi di agrumi sensibili ai viroidi sono alla base del mercato in crescita e redditizio degli “easy-peelers”, seguendo la tendenza mutevole nella preferenza dei consumatori per frutti facili da sbucciare, segmentati e senza semi ^4,5,6. Pertanto, i viroidi degli agrumi sono regolamentati dal Dipartimento per l’alimentazione e l’agricoltura della California (CDFA) “Citrus Nursery Stock Cleaning Program-Senate Bill 140” e i laboratori del Plant Pest Diagnostics Branch del CDFA eseguono migliaia di test sui viroidi degli agrumi ogni anno 7,8,9,10 . Il virus Citrus tristeza (CTV) è stato responsabile della morte di oltre 100 milioni di alberi di agrumi dall’inizio dell’epidemia globale negli anni ’30 3,9,10,11. In California, la vaiolatura del fusto e gli isolati di resistenza alla rottura trifogliata del virus rappresentano una seria minaccia per l’industria agrumicola californiana da 3,6 miliardi di dollari^12,13,14. Di conseguenza, il CDFA classifica il CTV come un parassita delle piante regolamentato di classe A e il laboratorio dell’Agenzia per l’eradicazione della tristeza della California centrale (CCTEA) esegue indagini approfondite sul campo e migliaia di test sui virus ogni anno^15,16. Si stima che il batterio “Candidatus Liberibacter asiaticus” (CLas) e la malattia huanglongbing (HLB) abbiano causato quasi 9 miliardi di dollari di danni economici alla Florida a causa di una riduzione del 40% della superficie coltivata a agrumi, una diminuzione del 57% delle operazioni di agrumi e una perdita di quasi 8.000^{posti di lavoro.} In California, si prevedeva che un’ipotetica riduzione del 20% della superficie coltivata a agrumi a causa dell’HLB avrebbe comportato la perdita di oltre 8.200 posti di lavoro e una riduzione di oltre mezzo miliardo di dollari nel prodotto interno lordo dello stato. Pertanto, il Citrus Pest and Disease Prevention Program spende oltre 40 milioni di dollari all’anno in indagini per testare, rilevare e sradicare CLas dalla California^14,17,19,20.

Un elemento chiave della gestione dei viroidi, dei virus e dei batteri degli agrumi è l’uso di materiali di propagazione testati contro i patogeni (ad esempio, gemme) per la produzione di alberi. Le gemme di agrumi testate per i patogeni vengono prodotte e mantenute nell’ambito di programmi di quarantena completi che impiegano tecniche avanzate di eliminazione e rilevamento dei patogeni^10,21. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l’Università della California, Riverside, testa ogni anno migliaia di campioni di gemme di varietà di agrumi importate di recente nello stato e negli Stati Uniti, nonché alberi di origine di gemme di agrumi, per proteggere gli agrumi della California e sostenere le funzioni del National Clean Plant Network for Citrus^10,17,22. Per gestire il grande volume di analisi degli agrumi, i saggi di rilevamento dei patogeni ad alta produttività, affidabili ed economici sono una componente fondamentale per il successo di programmi come il CCPP ^7,10,22.

Mentre i saggi di rilevamento dei patogeni su base molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR) hanno consentito un aumento significativo della produttività nei laboratori diagnostici vegetali, nella nostra esperienza, uno dei colli di bottiglia più critici nell’implementazione di protocolli ad alto rendimento è la fase di elaborazione dei campioni di tessuto vegetale. Ciò è particolarmente vero per gli agrumi perché i protocolli attualmente disponibili per la lavorazione di tessuti ricchi di floema come i piccioli delle foglie e la corteccia delle gemme sono laboriosi, richiedono tempo e attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questi protocolli richiedono la trinciatura manuale, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature per evitare la degradazione dell’acido nucleico 8,23,24. Ad esempio, presso il laboratorio diagnostico CCPP, l’elaborazione dei campioni comprende (i) la trinciatura manuale (6-9 campioni/h/operatore), (ii) la liofilizzazione (16-24 ore), (iii) la polverizzazione (30-60 s) e (iv) la centrifugazione (1-2 ore). Il processo richiede anche forniture specializzate (ad esempio, tubi con chiusura sicura per impieghi gravosi, sfere di macinazione in acciaio inossidabile, adattatori, lame, guanti) e più costose apparecchiature di laboratorio (ad esempio, congelatore ultra-basso, liofilizzatore, polverizzatore di tessuti, criostazione di azoto liquido, centrifuga refrigerata).

Come in qualsiasi settore, la progettazione delle apparecchiature e l’automazione dei processi sono fondamentali per ridurre i costi, aumentare la produttività e fornire prodotti e servizi uniformi e di alta qualità. L’industria agrumicola ha bisogno di strumenti per il trattamento dei tessuti a basso costo che richiedano competenze minime per funzionare e, in quanto tali, siano facili da trasferire ai laboratori diagnostici e alle operazioni sul campo per consentire un’elevata capacità di elaborazione dei campioni per un rapido rilevamento dei patogeni a valle. Technology Evolving Solutions (TES) e il CCPP hanno sviluppato (cioè progettato e fabbricato) e convalidato (cioè testato con campioni di agrumi e confrontato con le procedure di laboratorio standard) uno strumento a basso costo (cioè ha eliminato la necessità di attrezzature di laboratorio specializzate) per la lavorazione rapida di tessuti di agrumi ricchi di floema (cioè gemme), chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Come si vede nella Figura 1, il BTE include un componente di base per l’alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal gemma di agrumi. Il tessuto di corteccia sminuzzato viene espulso rapidamente attraverso una porta di scorrimento in una siringa contenente tampone di estrazione, filtrato e reso pronto per l’estrazione e la purificazione dell’acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva (Figura 1). Il sistema BTE comprende anche un’applicazione di tracciamento dei campioni senza carta e un’applicazione di pesatura integrata, che registrano le informazioni di elaborazione dei campioni in un database online in tempo reale.

Il sistema BTE ha aumentato la capacità diagnostica di laboratorio del CCPP di oltre il 100% e ha prodotto costantemente estratti di tessuto di agrumi adatti alla purificazione di acidi nucleici di alta qualità e al rilevamento a valle di agenti patogeni trasmissibili agli innesti di agrumi utilizzando saggi PCR. Più specificamente, BTE ha ridotto il tempo per l’elaborazione dei tessuti da oltre 24 ore a ~3 minuti per campione, ha sostituito gli strumenti di laboratorio che costano oltre $ 60.000 (Figura 2, passaggi 2-4) e ha consentito l’elaborazione di campioni di dimensioni maggiori.

Questo documento presenta i dati di convalida del trattamento del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento BTE, l’estrazione dell’acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni con campioni di gemme di agrumi da alberi di origine, inclusi tutti i controlli positivi e negativi appropriati rispettivamente dalla CCPP Rubidoux Quarantine Facility e dalla Lindcove Foundation Facility. Presentiamo anche le variazioni di produttività e tempo di elaborazione rispetto all’attuale procedura di laboratorio (Figura 2). Inoltre, questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e passo-passo per i laboratori di analisi dei patogeni degli agrumi e dimostra come il BTE possa supportare le funzioni dei programmi di nursery clean per i patogeni, l’indagine e l’eradicazione.

Figura 1: Estrattore di tessuto di gemme. Il BTE comprende un componente di base per l’alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal legno di agrumi. Il tessuto di corteccia triturato viene espulso rapidamente attraverso una porta scorrevole in una siringa, filtrato e preparato per l’estrazione e la purificazione dell’acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva. Abbreviazione: BTE = estrattore di tessuti di gemme. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Confronto passo dopo passo tra la procedura convenzionale di laboratorio di taglio manuale e la lavorazione BTE. L’elaborazione BTE comporta l’elaborazione del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento, l’estrazione dell’acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni. Il tempo per ogni passaggio è indicato tra parentesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Raccolta dei campioni di gemme di agrumi da spedire Inviare a Technology Evolving Solutions un foglio di calcolo con le informazioni sugli alberi da caricare nel server Web (alla fine, l’utente creerà nuovi alberi). Usa il localizzatore TES dell’app del telefono per selezionare un albero e tieni un collare NFC (Near Field Communication) tag sul telefono per caricare le informazioni sull’albero sul tag. Inserire tre o quattro campioni di gemme di agrumi n…

Representative Results

Estrazione, purificazione e qualità dell’RNA utilizzando tessuto di agrumi di gemme trattato con BTE e valutazione del tempo per la lavorazione dei tessutiPer questo test sono stati utilizzati campioni di gemme di 255 alberi di agrumi rappresentativi per confrontare la qualità dell’RNA del BTE rispetto alla procedura standard. I campioni sono stati processati dall’estrattore di tessuto di gemme (BTE) (fasi del protocollo 4.1-4.6 e Figura 2, lato destro, fase 1, fase 5 e fase 6) o preparati seguendo…

Discussion

Con l’avvento della malattia degli agrumi HLB, per ridurre le perdite, l’industria agrumicola, le agenzie di regolamentazione e i laboratori diagnostici sono stati esortati a fare affidamento su metodi di estrazione dell’acido nucleico ad alto rendimento combinati con l’elaborazione manuale dei campioni a basso rendimento e saggi di rilevamento dei patogeni come la qPCR³⁴ per l’analisi dei singoli alberi, in combinazione con le pratiche di gestione delle malattie³⁵. Il tass…

Materials

0.08" Hex Trimmer line	PowerCare	FPRO07065	Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor	California Air Tools	8010	Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube	Globe Scientific	111558B	Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set	Technology Evolving Solutions	TE006-F1-10A-G1000-E1	Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING – contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required – do not mix with bleach
12" Ruler	Westcott	‎16012	To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite	Hasa	1041	Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer	Insignia	NS-CZ70WH0	Store sample after processing
4" x 12" plastic bags	Plymor	FP20-4×12-10	Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab	Puritan	806-PCL	Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote	HDX	206152	Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun	JASTIND	‎JTABG103A	Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor	Brand	Z627569	Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber	Technology Evolving Solutions	TE002BB-A05-E1	Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap	Dawn	57445CT	Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter	Air Science	P5-36XT-A	Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container	PolarTech	261/J50C	Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat	Red Kap	KP14WH LN 46	Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop	Microsoft	Surface	Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone	Samsung	Galaxy S9	Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Clip-E1	Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag	Technology Evolving Solutions	TE005-Collar-E1	Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves	Usa Scientific	3915-4400	Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff	3M	90565-4DC-PS	Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose	FYPower	‎510019	Attaches air gun to compressor
Saftey glasses	Solidwork	SW8329-US	Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle	JohnBee	B08QM81BJV	Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base	Technology Evolving Solutions	TE001-A-E1	System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale	Technology Evolving Solutions	TE003-A05-200g-01-E1	200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield
Vermiculite	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter	Boenfu	‎BOWC-06002-US	Wire cutters to cut trimmer line