Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen
Summary
Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.
Abstract
In de afgelopen jaren is het aantal studies gewijd aan het vaststellen van het verband tussen mitochondriën en kanker aanzienlijk gestegen. Er zijn echter nog meer inspanningen nodig om het verband met veranderingen in mitochondriën en tumorigenese volledig te begrijpen, evenals om tumor-geassocieerde mitochondriale fenotypes te identificeren. Om bijvoorbeeld de bijdrage van mitochondriën in tumorigenese en metastaseprocessen te evalueren, is het essentieel om de invloed van mitochondriën van tumorcellen in verschillende nucleaire omgevingen te begrijpen. Voor dit doel bestaat een mogelijke benadering uit het overbrengen van mitochondriën naar een andere nucleaire achtergrond om de zogenaamde cybride cellen te verkrijgen. In de traditionele cybridisatietechnieken wordt een cellijn zonder mtDNA (ρ0, nucleaire donorcel) opnieuw bevolkt met mitochondriën die zijn afgeleid van enucleated cellen of bloedplaatjes. Het enucleatieproces vereist echter een goede celhechting aan de kweekplaat, een kenmerk dat in veel gevallen gedeeltelijk of volledig verloren gaat in invasieve cellen. Bovendien is een andere moeilijkheid die in de traditionele methoden wordt gevonden, het bereiken van volledige verwijdering van het endogene mtDNA uit de mitochondriale ontvangercellijn om zuivere nucleaire en mitochondriale DNA-achtergronden te verkrijgen, waarbij de aanwezigheid van twee verschillende mtDNA-soorten in het gegenereerde cybride wordt vermeden. In dit werk presenteren we een mitochondriaal uitwisselingsprotocol toegepast op suspensie-groeiende kankercellen op basis van de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën. Deze methodologie stelt ons in staat om de beperkingen van de traditionele benaderingen te overwinnen en kan dus worden gebruikt als een hulpmiddel om het begrip van de mitochondriale rol in kankerprogressie en metastase uit te breiden.
Introduction
Het herprogrammeren van het energiemetabolisme is een kenmerk van kanker1 dat voor het eerst werd waargenomen door Otto Warburg in de jaren 19302. Onder aerobe omstandigheden zetten normale cellen glucose om in pyruvaat, dat vervolgens acetyl-coA genereert, de mitochondriale machinerie voedt en cellulaire ademhaling bevordert. Niettemin toonde Warburg aan dat, zelfs onder normoxische omstandigheden, de meeste kankercellen pyruvaat verkregen uit het glycolyseproces omzetten in lactaat, waardoor ze hun weg verleggen om energie te verkrijgen. Deze metabole aanpassing staat bekend als het “Warburg-effect” en stelt sommige kankercellen in staat om te voorzien in hun energetische behoeften voor snelle groei en deling, ondanks het feit dat ATP minder efficiënt wordt gegenereerd dan het aërobe proces 3,4,5. In de afgelopen decennia hebben talrijke werken de implicatie van herprogrammering van het metabolisme in de progressie van kanker ondersteund. Vandaar dat tumor energetica wordt beschouwd als een interessant doelwit tegen kanker1. Als een centrale hub in het energetisch metabolisme en in de toevoer van essentiële voorlopers, spelen mitochondriën een sleutelrol in deze celaanpassingen die we tot op heden slechts gedeeltelijk begrijpen.
In overeenstemming met het bovenstaande zijn mitochondriale DNA (mtDNA) mutaties voorgesteld als een van de mogelijke oorzaken van deze metabole herprogrammering, die zou kunnen leiden tot een verminderde elektronentransportketen (ETC) prestaties6 en zou verklaren waarom sommige kankercellen hun glycolytische metabolisme verbeteren om te overleven. Er is inderdaad gemeld dat mtDNA mutaties in kankercellen accumuleert, aanwezig in ten minste 50% van de tumoren7. Een recente studie uitgevoerd door Yuan et al. meldde bijvoorbeeld de aanwezigheid van hypergemuteerde en afgeknotte mtDNA-moleculen in nier-, colorectale en schildklierkankers8. Bovendien hebben veel werken aangetoond dat bepaalde mtDNA-mutaties geassocieerd zijn met een agressiever tumorfenotype en met een toename van het metastatische potentieel van kankercellen 9,10,11,12,13,14,15,16.
Ondanks de schijnbare relevantie van het mitochondriale genoom in de progressie van kanker, is de studie van deze mutaties en hun bijdrage aan de ziekte een uitdaging geweest vanwege beperkingen in de experimentele modellen en technologieën die momenteel beschikbaar zijn17. Er zijn dus nieuwe technieken nodig om de echte impact van mitochondriaal DNA in de ontwikkeling en progressie van kankerziekten te begrijpen. In dit werk introduceren we een protocol voor transmitochondriale cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen, gebaseerd op de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën, dat de belangrijkste uitdagingen van traditionele cybridisatiemethoden overwint18,19. Deze methodologie maakt het gebruik van elke kerndonor mogelijk, ongeacht de beschikbaarheid van hun overeenkomstige ρ0-cellijn en de overdracht van mitochondriën van cellen die, volgens de traditionele technieken, moeilijk te enucleeren zouden zijn (d.w.z. niet-aanhangende cellijnen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinds Otto Warburg meldde dat kankercellen hun metabolisme verschuiven en “aerobe glycolyse” versterken3,4 terwijl ze mitochondriale ademhaling verminderen, is de interesse in de rol van mitochondriën in kankertransformatie en -progressie exponentieel gegroeid. In de afgelopen jaren zijn mutaties in het mtDNA en mitochondriale disfunctie gepostuleerd als kenmerken van veel kankertypen25. Tot op heden hebben talrijke studies de mtDNA-varia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidienummer PID2019-105128RB-I00 aan RSA, JMB en AA, en PGC2018-095795-B-I00 aan PFS en RML, beide gefinancierd door MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 en subsidienummers B31_20R (RSA, JMA en AA) en E35_17R (PFS en RML) en gefinancierd door Gobierno de Aragón. Het werk van RSA werd ondersteund door een subsidie van de Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. De auteurs willen graag het gebruik van Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza, erkennen.
Materials
| 3500XL Genetic Analyzer | ThermoFisher Scientific | 4406016 | |
| 6-well plate | Corning | 08-772-1B | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit | ThermoFisher Scientific | 4427368 | |
| Anode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4393927 | |
| Boric acid | PanReac | 131015 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Cathode Buffer Container 3500 Series | Applied Biosystems | 4408256 | |
| Cell culture flasks | TPP | 90076 | |
| DMEM high glucose | Gibco | 11965092 | |
| EDTA | PanReac | 131026 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E8751 | |
| Geneticin | Gibco | 10131027 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| L929 cell line | ATCC | CCL-1 | |
| MiniProtean Tetra4 Gel System | BioRad | 1658004 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| PCR primers | Sigma-Aldrich | Custom products | |
| Polyacrylamide Solution 30% | PanReac | A3626 | |
| Polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| POP-7 | Applied Biosystems | 4393714 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| QIAmp DNA Mini Kit | Qiagen | 51306 | |
| Rhodamine-6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Serum Fetal Bovine | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| SspI | New England Biolabs | R3132 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris | PanReac | P14030b | |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 |
References
- Hanahan, D. Hallmarks of cancer: new dimensions. Cancer Discovery. 12 (1), 31-46 (2022).
- Wind, F., Warburg, O. H. . The Metabolism of Tumors: Investigation from the Kaiser Wilhelm Institute for Biology. , (1930).
- Warburg, O. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 269-270 (1956).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Weinhouse, S. On respiratory impairment in cancer cells. Science. 124 (3215), 267-269 (1956).
- Brandon, M., Baldi, P., Wallace, D. C. Mitochondrial mutations in cancer. Oncogene. 25 (34), 4647-4662 (2006).
- Ju, Y. S., et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer. eLife. 3, 02935 (2014).
- Yuan, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers. Nature Genetics. 52 (3), 342-352 (2020).
- Arnold, R. S., et al. metastasis in prostate cancer: Recurring mitochondrial DNA mutation reveals selective pressure exerted by the bone microenvironment. Bone. 78, 81-86 (2015).
- Imanishi, H., et al. Mitochondrial DNA mutations regulate metastasis of human breast cancer cells. PLoS One. 6 (8), 23401 (2011).
- Lu, J., Sharma, L. K., Bai, Y. Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis. Cell Research. 19 (7), 802-815 (2009).
- Luo, Y., Ma, J., Lu, W. The significance of mitochondrial dysfunction in cancer. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5598 (2020).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers. 11 (7), 1027 (2019).
- Schopf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nature Communications. 11 (1), 1487 (2020).
- Yuan, Y., et al. Nonsense and missense mutation of mitochondrial ND6 gene promotes cell migration and invasion in human lung adenocarcinoma. BMC Cancer. 15, 346 (2015).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. 34;ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis"–a critical commentary. Free Radicals Biology and Medicine. 45 (9), 1217-1219 (2008).
- Welch, D. R., Foster, C., Rigoutsos, I. Roles of mitochondrial genetics in cancer metastasis. Trends in Cancer. 8 (12), 1002-1018 (2022).
- Cavaliere, A., Marchet, S., Di Meo, I., Tiranti, V. An in vitro approach to study mitochondrial dysfunction: A cybrid model. Journal of Visualized Experiments. (181), e63452 (2022).
- King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
- Bacman, S. R., Moraes, C. T. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 503-524 (2007).
- Moraes, C. T., Dey, R., Barrientos, A. Transmitochondrial technology in animal cells. Methods in Cell Biology. 65, 397-412 (2001).
- Acin-Perez, R., et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Molecular Cell. 13 (6), 805-815 (2004).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Bayona-Bafaluy, M. P., et al. Revisiting the mouse mitochondrial DNA sequence. Nucleic Acids Research. 31 (18), 5349-5355 (2003).
- Srinivasan, S., Guha, M., Kashina, A., Avadhani, N. G. Mitochondrial dysfunction and mitochondrial dynamics-The cancer connection. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1858 (8), 602-614 (2017).
- Bartoletti-Stella, A., et al. Mitochondrial DNA mutations in oncocytic adnexal lacrimal glands of the conjunctiva. Archives of Ophthalmology. 129 (5), 664-666 (2011).
- Chinnery, P. F., Samuels, D. C., Elson, J., Turnbull, D. M. Accumulation of mitochondrial DNA mutations in ageing, cancer, and mitochondrial disease: is there a common mechanism. The Lancet. 360 (9342), 1323-1325 (2002).
- Copeland, W. C., Wachsman, J. T., Johnson, F. M., Penta, J. S. Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Investigation. 20 (4), 557-569 (2002).
- Gasparre, G., et al. Clonal expansion of mutated mitochondrial DNA is associated with tumor formation and complex I deficiency in the benign renal oncocytoma. Human Molecular Genetics. 17 (7), 986-995 (2008).
- Kopinski, P. K., Singh, L. N., Zhang, S., Lott, M. T., Wallace, D. C. Mitochondrial DNA variation and cancer. Nature Review Cancer. 21 (7), 431-445 (2021).
- Pereira, L., Soares, P., Maximo, V., Samuels, D. C. Somatic mitochondrial DNA mutations in cancer escape purifying selection and high pathogenicity mutations lead to the oncocytic phenotype: pathogenicity analysis of reported somatic mtDNA mutations in tumors. BMC Cancer. 12, 53 (2012).
- Wallace, D. C. Mitochondria and cancer. Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).
- Hopkins, J. F., et al. Mitochondrial mutations drive prostate cancer aggression. Nature Communications. 8 (1), 656 (2017).
- Weerts, M. J. A., Smid, M., Foekens, J. A., Sleijfer, S., Martens, J. W. M. Mitochondrial RNA expression and single nucleotide variants in association with clinical parameters in primary breast cancers. Cancers. 10 (12), 500 (2018).
- Jimenez-Morales, S., Perez-Amado, C. J., Langley, E., Hidalgo-Miranda, A. Overview of mitochondrial germline variants and mutations in human disease: Focus on breast cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (3), 923-936 (2018).
- Hardie, D. G. AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 774-785 (2007).
- Perrone, A. M., et al. Potential for mitochondrial DNA sequencing in the differential diagnosis of gynaecological malignancies. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2048 (2018).
- Musicco, C., et al. Mitochondrial dysfunctions in type I endometrial carcinoma: Exploring their role in oncogenesis and tumor progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2076 (2018).
- Li, N., et al. Dissecting the expression landscape of mitochondrial genes in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. Oncology Letters. 16 (3), 3992-4000 (2018).
- Kim, H. R., et al. Spectrum of mitochondrial genome instability and implication of mitochondrial haplogroups in Korean patients with acute myeloid leukemia. Blood Research. 53 (3), 240-249 (2018).
- Tyagi, A., et al. Pattern of mitochondrial D-loop variations and their relation with mitochondrial encoded genes in pediatric acute myeloid leukemia. Mutation Research. 810, 13-18 (2018).
- Vidone, M., et al. A comprehensive characterization of mitochondrial DNA mutations in glioblastoma multiforme. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 63, 46-54 (2015).
- Chatterjee, A., Mambo, E., Sidransky, D. Mitochondrial DNA mutations in human cancer. Oncogene. 25 (34), 4663-4674 (2006).
- Arnold, R. S., et al. An inherited heteroplasmic mutation in mitochondrial gene COI in a patient with prostate cancer alters reactive oxygen, reactive nitrogen and proliferation. BioMed Research International. 2013, 239257 (2013).
- Petros, J. A., et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (3), 719-724 (2005).
- Wallace, D. C., Fan, W., Procaccio, V. Mitochondrial energetics and therapeutics. Annual Review of Pathology. 5, 297-348 (2010).
- Reznik, E., et al. Mitochondrial DNA copy number variation across human cancers. eLife. 5, 10769 (2016).
- Soler-Agesta, R., et al. PT-112 induces mitochondrial stress and immunogenic cell death, targeting tumor cells with mitochondrial deficiencies. Cancers. 14 (16), 3851 (2022).
- Trounce, I., Wallace, D. C. Production of transmitochondrial mouse cell lines by cybrid rescue of rhodamine-6G pre-treated L-cells. Somatic Cell and Molecular Genetics. 22 (1), 81-85 (1996).
- Pastushenko, I., Blanpain, C. EMT transition states during tumor progression and metastasis. Trends in Cell Biology. 29 (3), 212-226 (2019).
- Pastushenko, I., et al. Identification of the tumour transition states occurring during EMT. Nature. 556 (7702), 463-468 (2018).
- Thiery, J. P., Sleeman, J. P. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 131-142 (2006).
