Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Summary

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Abstract

Ces dernières années, le nombre d’études consacrées à la détermination du lien entre les mitochondries et le cancer a considérablement augmenté. Cependant, des efforts supplémentaires sont encore nécessaires pour bien comprendre le lien impliquant des altérations dans les mitochondries et la tumorigenèse, ainsi que pour identifier les phénotypes mitochondriaux associés aux tumeurs. Par exemple, pour évaluer la contribution des mitochondries dans les processus de tumorigenèse et de métastase, il est essentiel de comprendre l’influence des mitochondries des cellules tumorales dans différents environnements nucléaires. À cette fin, une approche possible consiste à transférer les mitochondries dans un fond nucléaire différent pour obtenir les cellules dites cybrides. Dans les techniques traditionnelles de cybridisation, une lignée cellulaire dépourvue d’ADNmt (ρ⁰, cellule donneuse nucléaire) est repeuplée avec des mitochondries dérivées de cellules énucléées ou de plaquettes. Cependant, le processus d’énucléation nécessite une bonne adhérence cellulaire à la plaque de culture, une caractéristique qui est partiellement ou complètement perdue dans de nombreux cas dans les cellules invasives. En outre, une autre difficulté trouvée dans les méthodes traditionnelles est d’obtenir l’élimination complète de l’ADNmt endogène de la lignée cellulaire mitochondriale réceptrice pour obtenir des arrière-plans d’ADN nucléaire et mitochondrial pur, évitant ainsi la présence de deux espèces d’ADNmt différentes dans la cybride générée. Dans ce travail, nous présentons un protocole d’échange mitochondrial appliqué aux cellules cancéreuses en suspension basée sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées. Cette méthodologie nous permet de surmonter les limites des approches traditionnelles et peut donc être utilisée comme un outil pour élargir la compréhension du rôle mitochondrial dans la progression du cancer et les métastases.

Introduction

La reprogrammation du métabolisme énergétique est une caractéristique du cancer¹ qui a été observé pour la première fois par Otto Warburg dans les années 1930². Dans des conditions aérobies, les cellules normales convertissent le glucose en pyruvate, qui génère ensuite de l’acétyl-coA, alimentant la machinerie mitochondriale et favorisant la respiration cellulaire. Néanmoins, Warburg a démontré que, même dans des conditions normoxiques, la plupart des cellules cancéreuses convertissent le pyruvate obtenu par le processus de glycolyse en lactate, changeant leur façon d’obtenir de l’énergie. Cet ajustement métabolique est connu sous le nom d’« effet Warburg » et permet à certaines cellules cancéreuses de répondre à leurs besoins énergétiques pour une croissance et une division rapides, malgré la génération d’ATP moins efficace que le processus aérobie ^3,4,5. Au cours des dernières décennies, de nombreux travaux ont soutenu l’implication de la reprogrammation du métabolisme dans la progression du cancer. Par conséquent, l’énergétique tumorale est considérée comme une cible intéressante contre le cancer¹. En tant que plaque tournante du métabolisme énergétique et de l’approvisionnement en précurseurs essentiels, les mitochondries jouent un rôle clé dans ces adaptations cellulaires que, à ce jour, nous ne comprenons que partiellement.

Conformément à ce qui précède, des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été proposées comme l’une des causes possibles de cette reprogrammation métabolique, ce qui pourrait entraîner une altération de la performance de la chaîne^de transport d’électrons (ETC) 6 et expliquerait pourquoi certaines cellules cancéreuses améliorent leur métabolisme glycolytique pour survivre. En effet, il a été rapporté que l’ADNmt accumule des mutations au sein des cellules cancéreuses, étant présent dans au moins 50% des^tumeurs7. Par exemple, une étude récente menée par Yuan et al. a rapporté la présence de molécules d’ADNmt hypermutées et tronquées dans les cancers du rein, colorectal et thyroïdien⁸. De plus, de nombreux travaux ont démontré que certaines mutations de l’ADNmt sont associées à un phénotype tumoral plus agressif et à une augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses 9,10,11,12,13,14,15,16.

Malgré la pertinence apparente du génome mitochondrial dans la progression du cancer, l’étude de ces mutations et de leur contribution à la maladie a été difficile en raison des limites des modèles expérimentaux et des technologies actuellement disponibles¹⁷. Ainsi, de nouvelles techniques pour comprendre l’impact réel de l’ADN mitochondrial dans le développement et la progression de la maladie cancéreuse sont nécessaires. Dans ce travail, nous introduisons un protocole pour la génération de cybrides transmitochondriales à partir de cellules cancéreuses en suspension à croissance, basé sur le repeuplement de cellules prétraitées à la rhodamine 6G avec des mitochondries isolées, qui surmonte les principaux défis des méthodes traditionnelles de cybridisation^18,19. Cette méthodologie permet l’utilisation de n’importe quel donneur de noyaux, indépendamment de la disponibilité de leur lignée cellulaire ρ⁰ correspondante et le transfert de mitochondries à partir de cellules qui, selon les techniques traditionnelles, seraient difficiles à énucléer (c’est-à-dire des lignées cellulaires non adhérentes).

Protocol

REMARQUE : Tous les milieux de culture et compositions tampons sont spécifiés dans le tableau 1. Avant la génération de cybrides, les profils d’ADN mitochondrial et nucléaire des cellules donneuses et receveuses doivent être typés pour confirmer la présence de différences génétiques dans les deux génomes entre les lignées cellulaires. Dans cette étude, une lignée cellulaire L929 disponible dans le commerce et sa lignée cellulaire dérivée, L929dt, qui a été générée spontanément d…

Representative Results

Après avoir suivi le protocole présenté ci-dessus, une lignée cellulaire cybride homoplasmique avec un fond nucléaire conservé mais avec un nouveau génotype mitochondrial devrait être obtenue, comme représenté dans les schémas de la figure 1 et de la figure 2. La pureté de l’ADN mitochondrial et nucléaire présent dans les cybrides peut être confirmée par RFLP, comme le montre la figure 3, et par l’analyse du gén…

Discussion

Depuis qu’Otto Warburg a rapporté que les cellules cancéreuses modifient leur métabolisme et potentialisent la « glycolyse aérobie »^3,4 tout en réduisant la respiration mitochondriale^, l’intérêt pour le rôle des mitochondries dans la transformation et la progression du cancer a augmenté de façon exponentielle. Ces dernières années, des mutations dans l’ADNmt et le dysfonctionnement mitochondrial ont été postulés comme caractéristiques de n…

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750