Transmitokondriell cybridgenerering med hjälp av cancercellinjer

Summary

Detta protokoll beskriver en teknik för cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller som ett verktyg för att studera mitokondriernas roll i den tumörframkallande processen.

Abstract

Under de senaste åren har antalet studier som syftar till att fastställa sambandet mellan mitokondrier och cancer ökat avsevärt. Men mer ansträngningar behövs fortfarande för att fullt ut förstå kopplingen som involverar förändringar i mitokondrier och tumörgenes, samt att identifiera tumörassocierade mitokondriella fenotyper. Till exempel, för att utvärdera mitokondriernas bidrag till tumörgenes och metastaseringsprocesser, är det viktigt att förstå påverkan av mitokondrier från tumörceller i olika kärnmiljöer. För detta ändamål består ett möjligt tillvägagångssätt av att överföra mitokondrier till en annan kärnbakgrund för att erhålla de så kallade cybridcellerna. I de traditionella cybridiseringsteknikerna återbefolkas en cellinje som saknar mtDNA (ρ⁰, kärndonatorcell) med mitokondrier härrörande från antingen enukleerade celler eller blodplättar. Enukleationsprocessen kräver dock god celladhesion till odlingsplattan, en egenskap som delvis eller helt förloras i många fall i invasiva celler. Dessutom är en annan svårighet som finns i de traditionella metoderna att uppnå fullständigt avlägsnande av det endogena mtDNA från mitokondriell mottagarcellinje för att erhålla ren kärn- och mitokondriell DNA-bakgrund, vilket undviker närvaron av två olika mtDNA-arter i den genererade cybriden. I detta arbete presenterar vi ett mitokondriellt utbytesprotokoll applicerat på suspensionsväxande cancerceller baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier. Denna metod gör det möjligt för oss att övervinna begränsningarna i de traditionella tillvägagångssätten och kan därmed användas som ett verktyg för att utöka förståelsen av mitokondriell roll i cancerprogression och metastasering.

Introduction

Omprogrammering av energimetabolism är ett kännetecken för cancer¹ som observerades för första gången av Otto Warburg på 1930-talet². Under aeroba förhållanden omvandlar normala celler glukos till pyruvat, som sedan genererar acetyl-coA, driver mitokondriella maskineriet och främjar cellulär andning. Ändå visade Warburg att även under normoxiska förhållanden omvandlar de flesta cancerceller pyruvat erhållet från glykolysprocessen till laktat och flyttar sig för att erhålla energi. Denna metaboliska justering är känd som “Warburg-effekten” och gör det möjligt för vissa cancerceller att tillgodose sina energiska krav på snabb tillväxt och delning, trots att de genererar ATP mindre effektivt än den aeroba processen ^3,4,5. Under de senaste decennierna har många verk stött implikationen av metabolism omprogrammering i cancerprogression. Därför anses tumörenergetik vara ett intressant mål mot cancer¹. Som ett centralt nav i energisk metabolism och i tillförseln av väsentliga prekursorer spelar mitokondrier en nyckelroll i dessa cellanpassningar som vi hittills bara delvis förstår.

I linje med ovanstående har mitokondriella DNA-mutationer (mtDNA) föreslagits som en av de möjliga orsakerna till denna metaboliska omprogrammering, vilket kan leda till en försämrad elektrontransportkedja (ETC) prestanda⁶ och skulle förklara varför vissa cancerceller förbättrar sin glykolytiska metabolism för att överleva. Det har faktiskt rapporterats att mtDNA ackumulerar mutationer i cancerceller, som finns i minst 50% av tumörerna⁷. Till exempel rapporterade en nyligen genomförd studie utförd av Yuan et al. närvaron av hypermuterade och trunkerade mtDNA-molekyler i njur-, kolorektal- och sköldkörtelcancer⁸. Dessutom har många arbeten visat att vissa mtDNA-mutationer är associerade med en mer aggressiv tumörfenotyp och med en ökning av den metastatiska potentialen hos cancerceller 9,10,11,12,13,14,15,16.

Trots den uppenbara relevansen av mitokondriellt genom i cancerprogression har studien av dessa mutationer och deras bidrag till sjukdomen varit utmanande på grund av begränsningar i de experimentella modeller och tekniker som för närvarande finns tillgängliga¹⁷. Således behövs nya tekniker för att förstå den verkliga effekten av mitokondri-DNA i utveckling och progression av cancersjukdomar. I detta arbete introducerar vi ett protokoll för transmitokondriell cybridgenerering från suspensionsväxande cancerceller, baserat på återinsättning av rhodamin 6G-förbehandlade celler med isolerade mitokondrier, som övervinner de viktigaste utmaningarna med traditionella cybridiseringsmetoder^18,19. Denna metod tillåter användning av alla kärndonatorer oavsett tillgängligheten av deras motsvarande ρ 0-cellinje och överföring av mitokondrier från celler som, enligt de traditionella teknikerna, skulle vara svåra att enukleera (dvs icke-vidhäftande cellinjer).

Protocol

Anmärkning: Alla odlingssubstrat och buffertsammansättningar specificeras i tabell 1. Före cybridgenerering måste både mitokondriella och nukleära DNA-profiler från givar- och mottagarcellerna skrivas för att bekräfta förekomsten av genetiska skillnader i båda genomerna mellan cellinjerna. I denna studie användes en kommersiellt tillgänglig L929-cellinje och dess härledda cellinje, L929dt, som genererades spontant i vårt laboratorium (se13 för mer information). Des…

Representative Results

Efter att ha följt det ovan presenterade protokollet bör en homoplasmatisk cybridcellinje med bevarad kärnbakgrund men med en ny mitokondriernas genotyp erhållas, såsom representeras i schemat i figur 1 och figur 2. Renheten hos mitokondriellt och nukleärt DNA i cybriderna kan bekräftas med RFLP, som visas i figur 3, och genom nukleär DNA-genotypanalys, som visas i figur 4. <p class="jove_co…

Discussion

Sedan Otto Warburg rapporterade att cancerceller skiftar sin ämnesomsättning och förstärker “aerob glykolys”^3,4 samtidigt som mitokondriell andning minskar^, har intresset för mitokondriernas roll i cancertransformation och progression ökat exponentiellt. Under de senaste åren har mutationer i mtDNA och mitokondriell dysfunktion postulerats som kännetecken för många cancertyper²⁵. Hittills har många studier analyserat mtDNA-varia…

Materials

3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750