一种使用纳米草本封装精油的抗菌织物

Summary

抗菌实验室外套可防止病原体积聚和意外生物溢出的交叉污染。在这里，我们描述了使用纳米草药封装和改良标准测试开发皮肤友好型抗菌织物的方案，以精确评估实验室外套典型用途的功效和适用性。

Abstract

实验室外套广泛用于生物危害实验室和医疗机构，作为防护服，以防止直接接触病原体、溢出物和烧伤。这些棉基保护层因其多孔性、保湿能力和从用户体内保持温暖而为微生物生长和附着部位提供了理想的条件。一些研究表明，医院服装和实验室外套上的致病菌存活，是微生物传播的载体。

解决这些问题的常见方法是在纺织品整理中使用抗菌剂，但由于许多合成化学品的毒性和环境影响，人们提出了担忧。持续的大流行也为研究有效的抗菌剂和环保无毒配方打开了一扇窗。这项研究使用两种天然生物活性化合物，香芹酚和百里酚，封装在壳聚糖纳米颗粒中，保证有效保护四种人类病原体，减少多达4个对数（99.99%）。这些病原体经常在生物危害实验室使用的实验室外套中检测到。

经过处理的织物还可以抵抗多达 10 次洗涤循环，微生物减少 90%，足以满足预期用途。我们对现有的标准织物测试进行了修改，以更好地代表实验室外套使用的典型场景。这些改进可以更准确地评估抗菌实验室涂层的有效性，并模拟必须在短时间内中和的任何意外微生物泄漏的命运。建议进一步研究，以调查与常规防护外套相比，抗菌实验室外套上病原体随时间推移的积累。

Introduction

白大褂防护是微生物实验室和医疗机构的强制性个人防护装备 （PPE），可防止直接接触病原体、溢出物和烧伤。由于许多因素，这些棉大衣促进了微生物的生长 – 机织织物提供附着部位和通气，制造过程中使用的棉花和淀粉以及来自用户的脱落上皮细胞提供营养，并且靠近用户提供温暖和水分。微生物在纺织品上的积累也会导致健康问题，例如过敏和院内感染、难闻的气味和织物变质¹.

与普通衣服不同，防护服很少清洗或消毒，正如^{许多调查所}发现的那样2^，3。许多研究表明，实验室外套是微生物传播的载体，在医疗保健环境中存在院内感染的风险²，4^，特别是耐药菌株³，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）;因此，它们引起了个人防护装备的健康问题，而个人防护装备旨在防止微生物污染。在生物安全2级（BSL-2）设施或微生物学教学实验室的背景下，没有足够的关于实验室外套相关感染的横断面研究，但许多监管机构限制在遏制级别内使用实验室外套。然而，由于实际限制，北美的许多学术机构都在努力满足要求，例如在设施内清洗和存放，在自助餐厅和图书馆等公共区域穿着实验室外套的事件很常见。解决这些问题的一个实用解决方案是在纺织品整理中使用抗菌剂。

抗菌织物在运动服、运动服和袜子中越来越受欢迎，主要是为了减少体味。然而，这些织物在个人防护装备开发中并不常见，除了一些镀银棉口罩和保健服装^5。我们报告了一种用于实验室外套的抗菌织物的开发，该织物可抑制BSL-2实验室中发现的常见病原体，并有效防止常见病原体的交叉污染。

目前，市场上有各种抗菌织物和整理剂，但其中大多数使用重金属胶体颗粒（例如银、铜、锌）、有机金属化合物或合成化学品，例如三氯生和季铵化合物，这些化合物对环境不友好¹ 并可能导致健康问题，例如皮肤刺激和过敏⁶.由于非目标微生物，例如正常菌群或诱导抗菌素耐药性（AMR），一些合成配方会引起关注。美国食品和药物管理局（FDA）对商业抗菌织物进行监管，这些织物必须对用户无毒且无生态毒性。因此，基于抑制广谱微生物的天然杀菌剂的抗菌织物是优选的。精油（EO）被广泛用作抗菌剂和治疗剂，但由于其耐用性⁶，⁷，^8，它们在抗菌整理中的使用受到限制。根据我们对纳米草药整理⁸的知识和市场研究，没有基于草药的抗菌织物可供市售。这是因为合成涂料易于制造且具有较长的耐用性。一些仅用于研究目的的纳米草药涂层纺织品包括印楝⁷，辣木9和咖喱叶⁹。

本研究使用从牛至EO中提取的两种生物活性成分，香芹酚和百里酚，它们对多种细菌病原体和病毒有效，但通常被认为对人类安全¹⁰。然而，这些生物活性成分是挥发性的，因此如果直接应用于织物，它们的抗菌潜力是短暂的。纳米草药封装是将生物活性成分或药物装载在聚合物外壳内的过程，可保护核心免受环境降解，从而延长保质期。此外，聚合物颗粒的小尺寸（通常范围为10 nm至100 nm）提高了应用的功效并减缓了生物活性化合物在织物上的释放。这些生物活性化合物用于各种目的，例如食品保鲜¹⁰，但不用于纺织品涂层。

在许多聚合物灌封剂中，壳聚糖因其许多属性（例如无毒、生物降解性、粘液粘附性和生物相容性）而成为有吸引力的候选者¹¹。它是一种天然多糖，通过几丁质的脱乙酰过程获得，甲壳素存在于贝壳和真菌细胞壁中。它用于生化和食品保鲜应用，例如药物或蛋白质递送¹¹、12、13^、控释 14 和抗菌膜 ¹⁰。壳聚糖不易溶于水，但在酸性介质中形成胶体悬浮液。生物活性分子通过简单的两步离子凝胶方法¹⁴，^15，16加载到壳聚糖纳米颗粒（NPs）中。在此过程中，疏水性生物活性化合物如香芹酚和麝香草酚形成水包油乳液，其由表面活性剂吐温80辅助。随后，使用聚阴离子化合物三聚磷酸五钠（TPP）在沿聚阳离子聚合物分子的氨基和TPP分子的磷酸基团之间形成交联以稳定复合物。这种络合过程固化了壳聚糖基质内的生物活性化合物，随后将其纯化并涂覆到棉板上以生产抗菌织物。

纳米配方在应用于织物之前，必须首先测试乳液形式的抗菌效果。这可以通过定性方法方便地进行评估，例如柯比-鲍尔盘扩散、孔扩散和圆柱板测定。然而，圆筒板测定¹⁷ 提供了加载不同体积的制剂和比较间隙区域的灵活性。在该方法中，将抗菌制剂装入不锈钢圆筒中并放置在软琼脂层上，该层接种有测试微生物或病原体。针对测试生物体产生的清除区的直径与抗菌制剂的抑制潜力成正比，因此可用作肉汤稀释方法的替代方法。然而，除非保持特定的标准，否则净区的大小只是特定板块内的比较或定性措施。抗菌剂通过抑制病原体的生长（生物静态）或杀死细胞（生物杀灭剂）来对抗病原体，这可以通过最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别进行量化。然而，生物活性化学品的功效和行为在其配方（液态）和涂覆在诸如织物的基材上时是不同的¹⁸。这是因为多种因素在功效中起作用，例如抗菌剂对织物的粘附稳定性、水分含量、底物类型和微生物的粘附性。如果预期目的只是抑菌活性，则诸如“平行条纹法”¹⁹ 之类的定性测定可以提供相对快速和容易的扩散抗菌制剂评估。但是，如果要确定杀菌效果，则可以采用“纺织材料抗菌整理剂评估”²⁰ ，从而减少加标病原体的对数。

Protocol

1. 纳米颗粒的制备 纳米草药封装准备 50 mL 的 1% （v/v） 乙酸。注意：冰醋酸是一种刺激物，会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。穿上全身实验室外套、丁腈手套和护目镜，并在通风橱下工作。 通过将0.6g壳聚糖薄片（中等分子量）溶解在50mL的1%乙酸（上述制备）中来制备壳聚糖溶液（1.2% w / v）。在室温（R / T）下搅拌过夜（O / N），以获得均匀的乳液。 <…

Representative Results

合成NPs的初步筛选按照两步水包油乳液技术16，生物活性化合物（香芹酚和百里酚）成功地包封在壳聚糖中。紫外-可见分光光度法证实了这一点，与对照组（不含任何生物活性化合物的壳聚糖NPs）相比，各个生物活性化合物的峰吸收。所构成的NPs在4 °C下12个月内均质且稳定。 通过气缸板法验证了抗菌效果的初步筛选（图1）。这是一种定性?…

Discussion

杀菌剂的抗菌功效通常通过定量测定进行测试，例如最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），其中将细菌浸入抗菌液体中24小时。然而，这些测定不适用于涂层织物，其中缺乏液体界面，杀菌剂沿着织物纤维缓慢扩散。因此，已经建立了许多标准的织物测试，例如AATCC 147，ISO 20645，AATCC 100和JIS L 1902。Pinho等人对这些标准的比较研究²³ 承认，对于使用最合适的方法尚未达成共?…

Materials

Acetic acid	Millipore Sigma	64-19-7
Antibiotic base agar	BD Difco	DF0270-17-4	Also known as Antibiotic Medium 2
Antibiotic seed agar	BD Difco	DF0263-17-3	Also known as Antibiotic Medium 1
Blood Agar (Nutrient Agar with 5% Sheep Blood)	Donated by CFIA
Bromcresol Purple Lactose Agar	Donated by CFIA
Candida albicans	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 10231
Carvacrol	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter	Model # X-22R	Refrigerated. Wait at least 20 min or until the temperature reach the set low value (e.g., 4 °C) as the refrigeration takes time.
Chitosan Medium Molecular Weight (CS)	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 23725
Incubator	Thermo Scientific	1205M34
Letheen Broth	BD Difco	DF0681-17-7	Used to neutralize antimicrobial effects. Product from different manufacturers may require to add Polysorbate 80, which is already added in Difco product.
Milli Q water	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	Deionized water
Mueller-Hinton Agar	BD Difco	DF0252-17-6
Pentasodium tripolyphosphate (TPP)	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
Phospahte Buffered Saline (PBS)	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar	BD Difco	DF0109-17-1
Shaking incubator/ Thermo shaker	VWR	Model# SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 6538
Thymol	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar	BD Difco	236950
Trypticase Soy Broth	BD Difco	215235
Tween 80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrophometer	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)