Summary

Secuenciación ultrarrápida de próxima generación basada en amplicones en el cáncer de pulmón no escamoso y no microcítico

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

El aumento de los biomarcadores moleculares que se deben probar para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NS-NSCLC) ha impulsado el desarrollo de métodos de detección molecular rápidos y fiables. Describimos un flujo de trabajo para la evaluación de la alteración genómica en pacientes con NSCLC-NSCLC utilizando un enfoque de secuenciación ultrarrápida de nueva generación (NGS).

Abstract

El número de alteraciones moleculares que se deben probar para la terapia dirigida de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NSCLC) ha aumentado significativamente en los últimos años. La detección de anomalías moleculares es obligatoria para la atención óptima de los pacientes con CPNM-NS-avanzado o metastásico, lo que permite administrar terapias dirigidas con una mejora de la supervivencia global. Sin embargo, estos tumores desarrollan mecanismos de resistencia que son potencialmente dianas mediante nuevas terapias. Algunas alteraciones moleculares también pueden modular la respuesta al tratamiento. La caracterización molecular del NSCLC debe realizarse en un tiempo de respuesta corto (TAT), en menos de 10 días hábiles, según lo recomendado por las guías internacionales. Además, el origen de las biopsias de tejido para análisis genómico es diverso, y su tamaño disminuye continuamente con el desarrollo de métodos y protocolos menos invasivos. En consecuencia, los patólogos se enfrentan al reto de realizar técnicas moleculares eficaces manteniendo una estrategia de diagnóstico eficiente y rápida. Aquí, describimos el flujo de trabajo ultrarrápido de secuenciación de próxima generación (NGS) basado en amplicones que se utiliza en la práctica rutinaria diaria en el momento del diagnóstico para pacientes con NSCLC. Demostramos que este sistema es capaz de identificar las dianas moleculares actuales utilizadas en medicina de precisión en oncología torácica en un TAT adecuado.

Introduction

Durante la última década, el desarrollo de terapias dirigidas e inmunoterapias ha aumentado significativamente la supervivencia global (SG) del cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas (NSCLC)1,2. En este sentido, el número de genes y dianas moleculares obligatorias a analizar en el tratamiento del CPNM-NS ha aumentado en los últimos años 3,4.

Las guías internacionales actuales recomiendan realizar pruebas de EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET y MET en el diagnóstico de NSCLC avanzado5. Además, dado que los nuevos fármacos han dado recientemente resultados muy prometedores en ensayos clínicos, en breve se detectarán alteraciones genómicas adicionales en una serie de genes adicionales, en particular KRAS y HER2, junto con BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 y NUT 6,7,8,9. Además, el estado de diferentes genes asociados, como STK11, KEAP1 y TP53, puede ser de gran interés para una mejor predicción de la respuesta o resistencia a algunas terapias dirigidas y/o inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI)10,11,12.

Es importante destacar que las alteraciones moleculares deben notificarse sin demora significativa para garantizar una toma de decisiones clínicas cuidadosa. La ausencia de caracterización molecular de un tumor puede llevar al inicio de terapias no dirigidas, como la quimioterapia con/sin inmunoterapia, lo que lleva a una estrategia de tratamiento subóptima, ya que la respuesta a la quimioterapia es limitada en pacientes con alteraciones procesables, como mutaciones en EGFR o fusiones génicas13.

Además, el desarrollo actual de terapias dirigidas/inmunoterapias en entornos neoadyuvantes y/o adyuvantes podría llevar a la búsqueda sistemática, al menos, de alteraciones de EGFR y ALK en el NSCLC en estadio temprano, ya que los ICI deben administrarse solo en tumores de tipo salvaje para EGFR y ALK14. Ahora también es obligatorio realizar pruebas para detectar la presencia de mutaciones en el CPNM-EGFR en estadio temprano, ya que el osimertinib (un inhibidor de la tirosina cinasa del EGFR de tercera generación) puede utilizarse como terapia adyuvante en el CPNM-NS-mutante en EGFR 15.

La estrategia para la evaluación de los diferentes biomarcadores en la predicción de la respuesta a diferentes terapias dirigidas y/o inmunoterapias en pacientes con CPNM-NS está avanzando rápidamente, lo que dificulta secuencialmente la identificación de estos biomarcadores 3,16. En este sentido, la secuenciación de nueva generación (NGS) es ahora el enfoque óptimo para la evaluación paralela de alto rendimiento de las alteraciones genéticas en el NSCLC 5,17.

Sin embargo, el flujo de trabajo de NGS puede ser difícil de dominar y puede llevar a un TAT18,19 más largo. Así, muchos centros siguen realizando abordajes secuenciales (inmunohistoquímica (IHQ), hibridación fluorescente in situ (FISH) y/o secuenciación dirigida). Sin embargo, esta estrategia es limitada en caso de que la muestra sea pequeña y, sobre todo, debido al mayor número de mutaciones accionables que deben analizarse en el NS-NSCLC20. Por lo tanto, los métodos de prueba ultrarrápidos y sencillos que permiten la evaluación rápida de las alteraciones genéticas se han vuelto cada vez más importantes para la toma de decisiones clínicas óptimas. Además, los sistemas aprobados y acreditados para las pruebas moleculares se están convirtiendo en obligatorios para la prescripción de terapias dirigidas específicas.

Aquí, describimos un ensayo NGS de ADN/ARN ultrarrápido y automatizado basado en amplicones para pruebas moleculares de NS-NSCLC que se utiliza en el Laboratorio de Laboratorio de Patología Clínica y Experimental (LPCE) del Hospital Universitario de Niza, Francia y está acreditado según la norma ISO 15189 por el Comité de Acreditación Francés (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). El COFRAC certifica que el laboratorio cumple con los requisitos de la norma ISO 15189 y las reglas de aplicación del COFRAC para las actividades de ensayo/calibración en análisis molecular en NGS automatizado en un secuenciador con el panel realizado por el laboratorio. La acreditación según la reconocida norma internacional ISO 15189 demuestra la competencia técnica del laboratorio para un alcance definido y el correcto funcionamiento de un sistema de gestión adecuado en este laboratorio. Se discuten los beneficios y limitaciones de este flujo de trabajo, desde la preparación de muestras de biopsia de tejido hasta la obtención del informe.

Protocol

Todos los procedimientos han sido aprobados por el comité de ética local (Comité de Ética de la Investigación en Seres Humanos, Centro Hospitalario Universitario de Niza, Tumorothèque BB-0033-00025). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes para el uso de muestras y datos generados. Todas las muestras se obtuvieron de pacientes diagnosticados de NSCLC en LPCE (Niza, Francia) entre el 20 de septiembre y el 31 de enero de 2022 como parte de la atención médica. 1…

Representative Results

Utilizando el procedimiento aquí presentado, descrito en detalle en nuestras publicaciones recientes21, desarrollamos un flujo de trabajo óptimo para la evaluación de la alteración molecular como prueba refleja en la práctica clínica realizada de forma rutinaria para el diagnóstico en pacientes con NSCLC utilizando un enfoque de secuenciación de próxima generación ultrarrápido basado en amplicones. El flujo de trabajo molecular del método se muestra en la Figura 1<…

Discussion

El desarrollo de un enfoque de NGS ultrarrápido basado en amplicones como prueba refleja para la evaluación de la alteración molecular en el diagnóstico de cualquier NS-NSLC en estadio es una opción óptima para la detección de todos los biomarcadores recomendados y emergentes recomendados por las guías en el NSCLC 5,22,23. Mientras que los métodos secuenciales (IHC, PCR, FISH) se centran solo en genes específicos y pue…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Thermo Fisher Scientific por darnos la posibilidad de utilizar su dispositivo y materiales.

Materials

96 well hard shell plate clear Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) 4483354
Adhesive PCR Plate Foil Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) AB0626
AutoLys M tube  Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A38738 FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40269
Genexus Pipette Tips Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40266
Genexus Purification Instrument Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A48148 Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40263
Genexus Integrated Sequencer Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A46291

References

  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
  3. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
  4. Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
  5. Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
  6. Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
  7. Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
  8. Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
  9. Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
  10. Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
  11. Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
  12. Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
  13. Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
  14. Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O’Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
  15. Wu, Y. -. L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
  16. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
  17. de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
  18. DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
  19. Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
  20. Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
  21. Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
  22. Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
  23. Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
  24. Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
  25. Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
  26. Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
  27. Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
  28. Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
  29. Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
  30. Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
  31. Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
  32. Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
  33. Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
  34. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
  35. Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
  36. Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
  37. Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
  38. Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
  39. Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
  40. Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
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Bontoux, C., Lespinet-Fabre, V., Bordone, O., Tanga, V., Allegra, M., Salah, M., Lalvée, S., Goffinet, S., Benzaquen, J., Marquette, C., Ilié, M., Hofman, V., Hofman, P. Ultra-Fast Amplicon-Based Next-Generation Sequencing in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer. J. Vis. Exp. (199), e65190, doi:10.3791/65190 (2023).

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