Summary

Ultrasnabb Amplicon-baserad nästa generations sekvensering i icke-skivepitel icke-småcellig lungcancer

Published: September 08, 2023
doi:

Summary

Ökningen av molekylära biomarkörer som ska testas för icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC) har föranlett utvecklingen av snabba och tillförlitliga molekylära detektionsmetoder. Vi beskriver ett arbetsflöde för bedömning av genomisk förändring för NS-NSCLC-patienter med hjälp av en ultrasnabb nästa generations sekvenseringsmetod (NGS).

Abstract

Antalet molekylära förändringar som ska testas för riktad behandling av patienter med icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC) har ökat avsevärt de senaste åren. Detektion av molekylära abnormiteter är obligatorisk för optimal vård av avancerade eller metastaserande NS-NSCLC-patienter, vilket gör det möjligt att administrera riktade terapier med en förbättring av den totala överlevnaden. Ändå utvecklar dessa tumörer resistensmekanismer som är potentiellt målinriktade med hjälp av nya terapier. Vissa molekylära förändringar kan också modulera behandlingssvaret. Den molekylära karakteriseringen av NS-NSCLC måste utföras på kort handläggningstid (TAT), på mindre än 10 arbetsdagar, enligt rekommendationerna i de internationella riktlinjerna. Dessutom är ursprunget till vävnadsbiopsierna för genomisk analys varierande, och deras storlek minskar kontinuerligt med utvecklingen av mindre invasiva metoder och protokoll. Följaktligen utmanas patologer att utföra effektiv molekylär teknik samtidigt som de upprätthåller en effektiv och snabb diagnosstrategi. Här beskriver vi det ultrasnabba amplicon-baserade arbetsflödet för nästa generations sekvensering (NGS) som används i den dagliga rutinrutinen vid diagnos för NS-NSCLC-patienter. Vi visade att detta system kan identifiera de nuvarande molekylära målen som används inom precisionsmedicin inom thoraxonkologi i en lämplig TAT.

Introduction

Under det senaste decenniet har utvecklingen av riktade terapier och immunterapier avsevärt ökat den totala överlevnaden (OS) för icke-skivepitel, icke-småcellig lungcancer (NS-NSCLC)1,2. I detta avseende har antalet obligatoriska gener och molekylära mål att analysera vid behandling av NS-NSCLC ökat under de senaste åren 3,4.

Nuvarande internationella riktlinjer rekommenderar testning av EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET och MET vid diagnos av avancerad NS-NSCLC5. Dessutom, eftersom nya läkemedel nyligen har gett mycket lovande resultat i kliniska prövningar, kommer ytterligare genomiska förändringar inom kort att screenas i ett antal ytterligare gener, särskilt KRAS och HER2, tillsammans med BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 och NUT 6,7,8,9. Dessutom kan statusen för olika associerade gener, såsom STK11, KEAP1 och TP53 vara av stort intresse för en bättre förutsägelse av svaret eller resistensen mot vissa riktade terapier och/eller immuncheckpointhämmare (ICI)10,11,12.

Det är viktigt att de molekylära förändringarna rapporteras utan betydande dröjsmål för att säkerställa noggrant kliniskt beslutsfattande. Frånvaron av molekylär karakterisering av en tumör kan leda till initiering av icke-riktade terapier såsom kemoterapi med/utan immunterapi, vilket leder till en suboptimal behandlingsstrategi, eftersom kemoterapisvaret är begränsat hos patienter med behandlingsbara förändringar, såsom EGFR-mutationer eller genfusioner13.

Dessutom kan den nuvarande utvecklingen av riktade terapier/immunterapier i neoadjuvanta och/eller adjuvanta miljöer leda till att man systematiskt letar efter, åtminstone, EGFR– och ALK-förändringar i tidiga stadier av NS-NSCLC, eftersom ICI endast bör administreras i tumörer som är vildtyper för EGFR och ALK14. Det är nu också obligatoriskt att testa för förekomst av EGFR-mutationer i NS-NSCLC i tidigt stadium, eftersom osimertinib (en tredje generationens EGFR-tyrosinkinashämmare) kan användas som adjuvant behandling vid EGFR-mutant NS-NSCLC15.

Strategin för bedömning av de olika biomarkörerna för att förutsäga svaret på olika riktade terapier och/eller immunterapier hos NS-NSCLC-patienter utvecklas snabbt, vilket gör identifieringen av dessa biomarkörer sekventiellt svår 3,16. I detta avseende är Next-Generation Sequencing (NGS) nu den optimala metoden för parallell bedömning av genförändringar i NS-NSCLC 5,17 med hög genomströmning.

NGS-arbetsflödet kan dock vara svårt att bemästra och kan leda till längre TAT18,19. Således utför många centra fortfarande sekventiella metoder (immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ-hybridisering (FISH) och/eller riktad sekvensering). Denna strategi är dock begränsad vid liten provstorlek och framför allt på grund av det ökade antalet handlingsbara mutationer som måste testas i NS-NSCLC20. Ultrasnabba och enkla testmetoder som möjliggör snabb bedömning av genförändringar har därför blivit allt viktigare för optimalt kliniskt beslutsfattande. Dessutom blir godkända och ackrediterade system för molekylär testning obligatoriska för förskrivning av specifika riktade terapier.

Här beskriver vi en ultrasnabb och automatiserad amplicon-baserad DNA/RNA NGS-analys för molekylär testning av NS-NSCLC som används i laboratoriet för klinisk och experimentell patologi (LPCE), Nice University Hospital, Frankrike och är ackrediterad enligt ISO 15189-normen av den franska ackrediteringskommittén (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC intygar att laboratoriet uppfyller kraven i standarden ISO 15189 och COFRAC:s tillämpningsregler för testning/kalibrering i molekylär analys i automatiserad NGS på en sequencer med panelen utförd av laboratoriet. Ackreditering enligt den erkända internationella standarden ISO 15189 visar laboratoriets tekniska kompetens för en definierad omfattning och att ett lämpligt ledningssystem fungerar korrekt i detta laboratorium. Fördelarna och begränsningarna med detta arbetsflöde, från beredning av vävnadsbiopsiprover till erhållande av rapporten, diskuteras.

Protocol

Alla procedurer har godkänts av den lokala etiska kommittén (Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025). Informerat samtycke inhämtades från alla patienter för att använda prover och genererade data. Alla prover togs från patienter som diagnostiserats med NS-NSCLC i LPCE (Nice, Frankrike) mellan 20 september och 31 januari 2022 som en del av den medicinska vården. 1. Beredning av FFPE DNA- och RNA-prover med hjälp av a…

Representative Results

Med hjälp av den procedur som presenteras här, som beskrivs i detalj i våra senaste publikationer21, utvecklade vi ett optimalt arbetsflöde för bedömning av molekylär förändring som en reflextestning i rutinmässigt utförd klinisk praxis för diagnos hos patienter med NS-NSCLC med hjälp av en ultrasnabb amplicon-baserad nästa generations sekvenseringsmetod. Metodens molekylära arbetsflöde visas i figur 1. Listan över gener som ingår i panelen visas i <…

Discussion

Utvecklingen av en ultrasnabb amplicon-baserad NGS-metod som reflextestning för molekylär förändringsbedömning vid diagnos av NS-NSLC i alla stadier är ett optimalt alternativ för detektion av alla riktlinjerekommenderade och framväxande biomarkörer i NS-NSCLC 5,22,23. Medan sekventiella metoder (IHC, PCR, FISH) endast fokuserar på specifika gener och kan resultera i utmattning av vävnadsmaterial, möjliggör detta NG…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Thermo Fisher Scientific för att de gav oss möjligheten att använda deras enhet och material.

Materials

96 well hard shell plate clear Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) 4483354
Adhesive PCR Plate Foil Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) AB0626
AutoLys M tube  Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A38738 FFPE sample processing tubes
Genexus Barcodes 1-32 HD Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40261
Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40269
Genexus Pipette Tips Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40266
Genexus Purification Instrument Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A48148 Automated purification instrument (API)
Genexus Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40271
Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A40263
Genexus Integrated Sequencer Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45727
Ion Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) A46291

References

  1. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  2. Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
  3. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
  4. Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
  5. Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
  6. Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
  7. Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
  8. Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
  9. Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
  10. Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
  11. Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
  12. Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
  13. Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
  14. Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O’Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
  15. Wu, Y. -. L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
  16. Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
  17. de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
  18. DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
  19. Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
  20. Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
  21. Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
  22. Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
  23. Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
  24. Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
  25. Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
  26. Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
  27. Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
  28. Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
  29. Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
  30. Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
  31. Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
  32. Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
  33. Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
  34. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
  35. Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
  36. Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
  37. Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
  38. Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
  39. Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
  40. Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
check_url/65190?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Bontoux, C., Lespinet-Fabre, V., Bordone, O., Tanga, V., Allegra, M., Salah, M., Lalvée, S., Goffinet, S., Benzaquen, J., Marquette, C., Ilié, M., Hofman, V., Hofman, P. Ultra-Fast Amplicon-Based Next-Generation Sequencing in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer. J. Vis. Exp. (199), e65190, doi:10.3791/65190 (2023).

View Video