Ultrahurtig ampliconbaseret næste generations sekventering i ikke-pladeformet ikke-småcellet lungekræft
Summary
Stigningen i molekylære biomarkører, der skal testes for ikke-pladeformet ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC) plejestyring, har ført til udvikling af hurtige og pålidelige molekylære detektionsmetoder. Vi beskriver en arbejdsgang til genomisk ændringsvurdering for NS-NSCLC-patienter ved hjælp af en ultrahurtig næste generations sekventering (NGS) tilgang.
Abstract
Antallet af molekylære ændringer, der skal testes til målrettet behandling af ikke-pladeformede ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC) patienter, er steget betydeligt de sidste par år. Påvisning af molekylære abnormiteter er obligatorisk for optimal pleje af avancerede eller metastatiske NS-NSCLC-patienter, hvilket gør det muligt at administrere målrettede terapier med en forbedring af den samlede overlevelse. Ikke desto mindre udvikler disse tumorer resistensmekanismer, der potentielt kan målrettes ved hjælp af nye terapier. Nogle molekylære ændringer kan også modulere behandlingsresponsen. Den molekylære karakterisering af NS-NSCLC skal udføres i en kort ekspeditionstid (TAT) på mindre end 10 arbejdsdage som anbefalet af de internationale retningslinjer. Derudover er oprindelsen af vævsbiopsier til genomisk analyse forskelligartet, og deres størrelse falder løbende med udviklingen af mindre invasive metoder og protokoller. Derfor udfordres patologer til at udføre effektive molekylære teknikker, samtidig med at de opretholder en effektiv og hurtig diagnosestrategi. Her beskriver vi den ultrahurtige ampliconbaserede næste generations sekventering (NGS) arbejdsgang, der anvendes i daglig rutinepraksis ved diagnose for NS-NSCLC-patienter. Vi viste, at dette system er i stand til at identificere de nuværende molekylære mål, der anvendes i præcisionsmedicin i thorax onkologi i en passende TAT.
Introduction
I løbet af det sidste årti har udviklingen af målrettede terapier og immunterapier signifikant øget den samlede overlevelse (OS) af ikke-pladeformet ikke-småcellet lungekræft (NS-NSCLC)1,2. I denne henseende er antallet af obligatoriske gener og molekylære mål, der skal analyseres ved behandling af NS-NSCLC, steget i løbet af de sidste par år 3,4.
Nuværende internationale retningslinjer anbefaler at teste EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET og MET ved diagnosticering af avanceret NS-NSCLC5. Da nye lægemidler for nylig har givet meget lovende resultater i kliniske forsøg, vil yderligere genomiske ændringer desuden snart blive screenet i en række yderligere gener, især KRAS og HER2, sammen med BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 og NUT 6,7,8,9. Derudover kan status for forskellige associerede gener, såsom STK11, KEAP1 og TP53, være af stor interesse for en bedre forudsigelse af respons eller resistens over for nogle målrettede terapier og/eller immuncheckpointhæmmere (ICI’er)10,11,12.
Det er vigtigt, at de molekylære ændringer rapporteres uden væsentlig forsinkelse for at sikre omhyggelig klinisk beslutningstagning. Fraværet af molekylær karakterisering af en tumor kan føre til initiering af ikke-målrettede terapier såsom kemoterapi med/uden immunterapi, hvilket fører til en suboptimal behandlingsstrategi, da kemoterapirespons er begrænset hos patienter med handlingsrettede ændringer, såsom EGFR-mutationer eller genfusioner13.
Desuden kan den nuværende udvikling af målrettede terapier/immunterapier i neoadjuverende og/eller adjuverende miljøer føre til systematisk søgning efter i det mindste EGFR– og ALK-ændringer i NS-NSCLC i tidlige stadier, da ICI’er kun bør administreres i tumorer, der er vildtype for EGFR og ALK14. Det er nu også obligatorisk at teste for tilstedeværelsen af EGFR-mutationer i NS-NSCLC i tidlige stadier, da osimertinib (en tredje generations EGFR-tyrosinkinasehæmmer) kan anvendes som adjuverende behandling i EGFR-mutant NS-NSCLC 15.
Strategien for vurdering af de forskellige biomarkører til forudsigelse af respons på forskellige målrettede terapier og/eller immunterapier hos NS-NSCLC-patienter bevæger sig hurtigt, hvilket gør identifikationen af disse biomarkører sekventielt vanskelig 3,16. I denne henseende er Next-Generation Sequencing (NGS) nu den optimale tilgang til parallel vurdering af genændringer i NS-NSCLC 5,17 med høj kapacitet.
NGS-arbejdsgangen kan dog være vanskelig at mestre og kan føre til længere TAT 18,19. Således udfører mange centre stadig sekventielle tilgange (immunhistokemi (IHC), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og / eller målrettet sekventering). Denne strategi er imidlertid begrænset i tilfælde af lille stikprøvestørrelse og frem for alt på grund af det øgede antal handlingsrettede mutationer, der skal testes i NS-NSCLC20. Således er ultrahurtige og enkle testmetoder, der muliggør hurtig vurdering af genændringer, blevet stadig vigtigere for optimal klinisk beslutningstagning. Desuden bliver godkendte og akkrediterede systemer til molekylær testning obligatoriske for ordination af specifikke målrettede terapier.
Her beskriver vi et ultrahurtigt og automatiseret ampliconbaseret DNA/RNA NGS-assay til molekylær test af NS-NSCLC, der anvendes i laboratoriet for klinisk og eksperimentel patologisk laboratorium (LPCE), Nice Universitetshospital, Frankrig og er akkrediteret i henhold til ISO 15189-normen af den franske akkrediteringskomité (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). COFRAC certificerer, at laboratoriet opfylder kravene i standarden ISO 15189 og COFRAC regler for anvendelse af test/kalibrering i molekylær analyse i automatiseret NGS på en sequencer med panelet udført af laboratoriet. Akkreditering i henhold til den anerkendte internationale standard ISO 15189 demonstrerer laboratoriets tekniske kompetence til et defineret omfang og korrekt drift af et passende styringssystem i dette laboratorium. Fordelene og begrænsningerne ved denne arbejdsgang, der starter fra forberedelsen af vævsbiopsiprøver til opnåelse af rapporten, diskuteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af en ultrahurtig ampliconbaseret NGS-tilgang som reflekstest til molekylær ændringsvurdering ved diagnose af ethvert trin NS-NSLC er en optimal mulighed for påvisning af alle retningslinjeanbefalede og nye biomarkører i NS-NSCLC 5,22,23. Mens sekventielle metoder (IHC, PCR, FISH) kun fokuserer på specifikke gener og kan resultere i udmattelse af vævsmateriale, tillader denne NGS-arbejdsgang en specifik og føl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Thermo Fisher Scientific for at give os mulighed for at bruge deres enhed og materialer.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
References
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Melosky, B., et al. The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).
- Kerr, K. M., et al. The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe. Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).
- Mosele, F., et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group. Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).
- Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications. Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).
- Li, B. T., et al. Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).
- Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner. Cancers. 14 (7), 1628 (2022).
- Skoulidis, F., et al. Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation. New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).
- Hellyer, J. A., et al. Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer. Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).
- Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas. Diagnostics. 11 (2), 196 (2021).
- Nadal, E., et al. Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation. JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).
- Smeltzer, M. P., et al. The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).
- Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O’Byrne, K., Hughes, B. G. M. Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248 (2021).
- Wu, Y. -. L., et al. Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).
- Hanna, N. H., et al. Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update. J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).
- de Maglio, G., et al. The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561 (2022).
- DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis. Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).
- Heeke, S., et al. Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients. Cancers. 10 (4), 88 (2018).
- Hofman, P. The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients. Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).
- Ilié, M., et al. Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France). Cancers. 14 (9), 2258 (2022).
- Zacharias, M., et al. Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience. Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).
- Miller, T. E., et al. Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).
- Al-Ahmadi, A., et al. Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival. Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).
- Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma. Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).
- Sheffield, B. S., et al. Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care. Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).
- Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).
- Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer. Cancers. 13 (20), 5038 (2021).
- Shapiro, G. I., et al. A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma. British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).
- Schoenfeld, A. J., et al. The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).
- Zhang, K., et al. Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).
- Shen, C. I., et al. Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer. Scientific Reports. 12 (1), 13566 (2022).
- Zou, D., et al. Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States. Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).
- Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. Application of next generation sequencing in laboratory medicine. Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).
- Bruno, R., Fontanini, G. Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review. Diagnostics. 10 (8), 521 (2020).
- Hofman, V., et al. Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer. JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457 (2022).
- Horgan, D., et al. Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe. Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72 (2022).
- Cohen, D., et al. Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing. Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).
- Goswami, R. S., et al. Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors. American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).
- Ilie, M., Hofman, P. Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice. Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).
