Sequenciamento de última geração baseado em amplicon ultrarrápido em câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas
Summary
O aumento de biomarcadores moleculares a serem testados para o manejo do cuidado do câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC-NS) tem impulsionado o desenvolvimento de métodos de detecção molecular rápidos e confiáveis. Descrevemos um fluxo de trabalho para avaliação de alterações genômicas para pacientes com CPNPC-NS usando uma abordagem de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápida.
Abstract
O número de alterações moleculares a serem testadas para terapia-alvo de pacientes com câncer de pulmão não pequenas células não escamosas (CPNPC) tem aumentado significativamente nos últimos anos. A detecção de anormalidades moleculares é mandatória para o tratamento ideal de pacientes com CPNPC NS avançado ou metastático, permitindo que terapias-alvo sejam administradas com melhora na sobrevida global. No entanto, esses tumores desenvolvem mecanismos de resistência que são potencialmente direcionáveis usando novas terapias. Algumas alterações moleculares também podem modular a resposta ao tratamento. A caracterização molecular do CPCNP deve ser realizada em um curto tempo de resposta (TAT), em menos de 10 dias úteis, conforme recomendado pelas diretrizes internacionais. Além disso, a origem das biópsias teciduais para análise genômica é diversa, e seu tamanho está diminuindo continuamente com o desenvolvimento de métodos e protocolos menos invasivos. Consequentemente, os patologistas estão sendo desafiados a realizar técnicas moleculares eficazes, mantendo uma estratégia de diagnóstico eficiente e rápida. Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho de sequenciamento de próxima geração (NGS) ultrarrápido baseado em amplicon usado na prática diária de rotina no diagnóstico de pacientes com CPNPC-NS. Mostramos que este sistema é capaz de identificar os atuais alvos moleculares utilizados em medicina de precisão em oncologia torácica em um TAT apropriado.
Introduction
Na última década, o desenvolvimento de terapias direcionadas e imunológicas aumentou significativamente a sobrevida global (SG) do câncer de pulmão não escamoso de células não pequenas (CPCNP)1,2. Nesse sentido, o número de genes obrigatórios e alvos moleculares a serem analisados no tratamento do CPNPC-NS tem aumentado nos últimos anos 3,4.
As diretrizes internacionais atuais recomendam testar EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, e MET no diagnóstico de NS-NS 5avançado. Além disso, como novas drogas têm recentemente dado resultados muito promissores em ensaios clínicos, alterações genômicas adicionais serão rastreadas em breve em vários genes adicionais, notadamente KRAS e HER2, juntamente com BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 e NUT 6,7,8,9. Além disso, o status de diferentes genes associados, como STK11, KEAP1 e TP53, pode ser de forte interesse para uma melhor predição da resposta ou resistência a algumas terapias-alvo e/ou inibidores de checkpoints imunes (ICIs)10,11,12.
É importante ressaltar que as alterações moleculares devem ser relatadas sem demora significativa para garantir a tomada de decisão clínica cuidadosa. A ausência de caracterização molecular de um tumor pode levar ao início de terapias não direcionadas, como quimioterapia com/sem imunoterapia, levando a uma estratégia de tratamento subótima, uma vez que a resposta à quimioterapia é limitada em pacientes com alterações acionáveis, como mutações no EGFR ou fusões gênicas13.
Além disso, o desenvolvimento atual de terapias-alvo/imunoterapias em ambientes neoadjuvantes e/ou adjuvantes poderia levar à busca sistemática, pelo menos, de alterações de EGFR e ALK no CPCNP em estágio inicial, uma vez que as ICIs devem ser administradas apenas em tumores selvagens para EGFR e ALK14. Agora, também é obrigatório testar a presença de mutações no EGFR no CPCNP (CPCNP com gene e SN em estágio inicial), uma vez que o osimertinibe (um inibidor da tirosina quinase do EGFR de terceira geração) pode ser usado como terapia adjuvante no CPCNP mutante para EGFR 15.
A estratégia para a avaliação dos diferentes biomarcadores na predição da resposta a diferentes terapias-alvo e/ou imunoterapias em pacientes com CPNPC-NS está avançando rapidamente, o que torna a identificação desses biomarcadores sequencialmente difícil 3,16. Nesse sentido, o Next-Generation Sequencing (NGS) é atualmente a abordagem ideal para a avaliação paralela de alto rendimento de alterações gênicas no NS-NS-CPNPC 5,17.
No entanto, o fluxo de trabalho da SNG pode ser difícil de dominar e pode conduzir a TAT mais longa18,19. Assim, muitos centros ainda realizam abordagens sequenciais (imunohistoquímica (IHQ), hibridização in situ fluorescente (FISH) e/ou sequenciamento direcionado). No entanto, essa estratégia é limitada em caso de pequeno tamanho de amostra e, sobretudo, devido ao maior número de mutações acionáveis que são necessárias para serem testadas no NS-NSCLC20. Assim, métodos de teste ultrarrápidos e diretos, permitindo a avaliação rápida de alterações gênicas, tornaram-se cada vez mais importantes para a tomada de decisões clínicas ideais. Além disso, sistemas aprovados e acreditados para testes moleculares estão se tornando obrigatórios para a prescrição de terapias-alvo específicas.
Aqui, descrevemos um ensaio DNA/RNA NGS ultrarrápido e automatizado baseado em amplicon para testes moleculares de NS-NSCLC que é usado no Laboratório de Patologia Clínica e Experimental (LPCE), Hospital Universitário de Nice, França e é acreditado de acordo com a norma ISO 15189 pelo Comitê Francês de Acreditação (COFRAC) (https://www.cofrac.fr/). O COFRAC certifica que o laboratório cumpre os requisitos da norma ISO 15189 e as regras de aplicação do COFRAC para as atividades de ensaio/calibração em análises moleculares em NGS automatizado em um sequenciador com o painel realizado pelo laboratório. A acreditação pela reconhecida norma internacional ISO 15189 demonstra a competência técnica do laboratório para um escopo definido e o bom funcionamento de um sistema de gestão adequado neste laboratório. Os benefícios e limitações desse fluxo de trabalho, desde a preparação das amostras de biópsia tecidual até a obtenção do laudo, são discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenvolvimento de uma abordagem NGS ultrarrápida baseada em amplicon como teste reflexo para avaliação de alterações moleculares no diagnóstico de qualquer estágio NS-NSLC é uma opção ideal para a detecção de todos os biomarcadores emergentes e recomendados pelas diretrizes em NS-NS 5,22,23. Enquanto os métodos sequenciais (IHC, PCR, FISH) se concentram apenas em genes específicos e podem resultar em exaustão d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Thermo Fisher Scientific por nos dar a possibilidade de usar seu dispositivo e materiais.
Materials
| 96 well hard shell plate clear | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | 4483354 | |
| Adhesive PCR Plate Foil | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | AB0626 | |
| AutoLys M tube | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A38738 | FFPE sample processing tubes |
| Genexus Barcodes 1-32 HD | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40261 | |
| Genexus GX5 Chip and Genexus Coupler | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40269 | |
| Genexus Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40266 | |
| Genexus Purification Instrument | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A48148 | Automated purification instrument (API) |
| Genexus Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40271 | |
| Genexus Templating Strips 3-GX5 and 4 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A40263 | |
| Genexus Integrated Sequencer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45727 | |
| Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA Purification Combo Kit | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A45539 | |
| Oncomine Precision Assay GX (OPA) Panel (included Strips 1 and 2-HD) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) | A46291 |
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